Significance of antibody detection to individual B-epitopes of envelope proteins of hepatitis C virus

Full Text

Введение

Вирусный гепатит С – парентеральная инфекция, этиологическим агентом которой является РНК-содержащий вирус гепатита С (ВГС), принадлежащий к роду Hepacivirus семейства Flaviviridae. Гепатит С является основной причиной тяжелых инвалидизирующих заболеваний печени. Эксперты ВОЗ считают, что ежегодно около 2 млн людей заражаются ВГС и около 500 тыс. умирают от последствий хронического гепатита С (ХГС) [1]. Острый гепатит С (ОГС) может протекать скрытно, в безжелтушной форме, и приблизительно в 25% случаев завершаться самопроизвольной элиминацией ВГС [2]. Соответственно, в 75% случаев развивается ХГС, который может привести к циррозу печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциноме.

ВГС – сферический оболочечный вирус, геном которого представлен одноцепочечной РНК положительной полярности, состоящей примерно из 9600 нуклеотидов. Вирусный геном имеет одну уникальную открытую рамку считывания и кодирует полипротеин, содержащий около 3030 аминокислотных остатков (а. о.). Из последнего путем ферментативного протеолиза выщепляются структурные белки (нуклеокапсидный и оболочечные E1, E2) и неструктурные полипептиды (p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a и NS5b).

Оболочечные гликопротеины E1 и E2 взаимодействуют с рецепторами, участвуют в процессе проникновения вируса в клетки хозяина и являются основными мишенями вируснейтрализующих антител (ВНА), специфичных к ВГС [3, 4]. Ранее было показано, что появление ВНА на 48-й неделе после заражения сопровождалось последующей элиминацией вируса на 65-й неделе, что подтверждает значительную роль ВНА в контроле над ВГС-инфекцией [5]. После элиминации вируса титр ВНА быстро снижался. Напротив, у пациентов с последующим развитием ХГС наблюдалось отсутствие или низкий титр ВНА во время острой фазы инфекции и с нарастанием величины титра во время ХГС [6].

Большинство ВНА нацелены на эпитопы в гликопротеине Е2 [7]. Изучение ВНА против E1 осложнено тем, что правильный процессинг и фолдинг E1 в отсутствие E2 не происходит [8]. Тем не менее несколько исследований продемонстрировали, что две основные области E1 являются мишенями для ВНА. Первая область представляет собой N-концевую часть белка (а. о. 192–207), которую распознают человеческие моноклональные антитела (Н111), проявляющие слабую вируснейтрализующую активность [9]. Вторая иммуногенная область (а. о. 313–327), распознаваемая двумя моноклональными антителами (IGH505 и IGH526) с широкой нейтрализующей специфичностью, расположена на С-конце эктодомена E1 и является иммунодоминантной [10].

В-клеточные эпитопы гликопротеина Е2 изучены более интенсивно, чем аналогичные эпитопы гликопротеина Е1. В белке Е2 выявлены иммунодоминантные антигенные участки AS412 (а. о. 412–423) и AS434 (а. о. 434–446), антигенная область АР3 и гипервариабельная область 1 (HVR1) (а. о. 384–411) [11]. Одной из главных мишеней ВНА во время острой и хронической инфекции является область HVR1 [12]. Ранее было показано, что на пептид, соответствующий N-концевому эпитопу HVR1, наиболее часто выявляются антитела у больных острым гепатитом С, а на пептид, соответствующий С-концевому эпитопу HVR1, – у больных ХГС [13].

Цель настоящего исследования – выявить антитела к пептидам, воспроизводящим консервативные В-клеточные эпитопы оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС, и оценить их возможную значимость для прогноза элиминации вируса.

Материалы и методы исследований

Синтез пептидов осуществляли твердофазным методом путем наращивания пептидной цепи на полимерном носителе Ванга по Fmoc-протоколу в ручном режиме карбодиимидным способом и методом активированных эфиров, используя Fmoc-аминокислоты и их производные L-конфигурации (Merck, Германия) и стандартный протокол проведения синтетического цикла, закрытия непрореагировавших аминогрупп и отщепления пептида от полимерного носителя. Полноту реакции сочетания проверяли тестом Кайзера. Очистку пептидов осуществляли обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией, структуру синтезированных пептидов подтверждали масс-спектрометрией MALDI-TOF (Bruker, Германия).

Пептид I имел первичную структуру AVTPTVATRDGKLPAT и воспроизводил иммуногенный В-эпитоп, соответствующий аминокислотным позициям 244–259 белка Е1. Пептид II имел первичную структуру ITGHRMAWDMMM, соответствовал аминокислотным позициям 313–324 белка Е1 и воспроизводил консервативный иммунодоминантный В-эпитоп. Пептид III имел консенсусную первичную структуру HTASGFASFLSPGPKQN, соответствовал аминокислотным позициям белка Е2 395–411 и воспроизводил C-концевой В-эпитоп первого гипервариабельного региона [14].

Процедуру иммуноферментного анализа осуществляли в 96-луночных планшетах MediSorb (Nunc, Дания), сорбируя пептиды в лунки в концентрации 30 мкг/1 мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5) на протяжении 16 ч при 4 °C. После закрытия участков неспецифического связывания бычьим сывороточным альбумином (1 мг/мл; Sigma, США) в 0,05 M фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) в лунки вносили сыворотки в разведении 1:10. Дальнейшие этапы выполняли как описано ранее [13]. Результаты ИФА регистрировали, используя спектрофотометр StatFax 3200 (Awareness Technology, США), измеряя оптическую плотность (ОП) в двухволновом режиме: 450 нм (основной фильтр) и 650 нм (референс-фильтр). Результаты ИФА образцов представляли в виде коэффициента позитивности (КП), который рассчитывали, как отношение ОП образца к пороговой величине ОП. Последнюю величину определяли как сумму средней арифметической величины ОП от 10 отрицательных образцов и двухкратной стандартной ошибки среднего.

Сыворотки крови от 63 участников (30 мужчин и 33 женщины) с вирусным гепатитом С (без ВИЧ-инфекции и наличия вирусных гепатитов иной этиологии) были собраны в период с 2015 по 2019 г. Проведение данного исследования выполнено с соблюдением норм Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации и одобрено этическим комитетом Российской медицинской академии непрерывного профессионального образования. Участники исследования дали информированное согласие.

Группу с острым гепатитом С составили 8 человек в возрасте 24–32 года (мужчин – 3, женщин – 5). Группа без лечения сформирована из 25 участников в возрасте 36–57 лет (мужчин – 17, женщин – 8). У 4 участников стадии фиброза составили F3 и F4, у остальных – от F0 до F2. Участники, получавшие терапию препаратами прямого противовирусного действия (ПППД), вошли в третью группу (n = 30), диапазон возраста 25–64 (мужчин – 19, женщин – 11). Стадии фиброза F3 и F4 у 4 участников, от F0 до F2 – у остальных.

Стадии фиброза печени выявляли методом транзиентной фиброэластометрии на приборе Fibroscan FS502 (Echosens, Франция). Для оценки степени выраженности фиброза использовали шкалу METAVIR.

С целью подтверждения диагноза и фазы инфекции выявляли геном вируса методом ОТ-ПЦР («РеалБест РНК HCV», качественный или количественный вариант, Вектор-Бест, РФ) и специфические антитела методом ИФА («РекомбиБест анти-ВГС IgM» и «Бест анти-ВГС – спектр», Вектор-Бест, РФ).

Статистическую обработку полученных данных выполняли, используя пакет программ Statistica v. 10.0 (StatSoft Inc., Tulsa, США). Количественные показатели представляли как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего. При наличии нормального распределения для оценки достоверности различий использовали t критерий Стьюдента, при ином распределении применяли χ2 критерий, в случае необходимости использовали тест с поправкой Йетса и точный метод Фишера. Различия между сравниваемыми величинами считали достоверными при р < 0,05.

Результаты исследований

Среди проанализированных 63 образцов (от 63 пациентов) антитела к пептидам были обнаружены в 35 пробах, что соответствует частоте обнаружения 55,6 ± 6,3%. На рис. 1 представлена частота выявления антител к трем пептидам.

 

Рис. 1. Частота обнаружения (в %) антител к трем пептидам с учетом ошибки выборки

 

Частота обнаружения антител к отдельным трем пептидам была без значимых различий, т. е. ярко выраженного доминирования какого-либо пептида не отмечено.

Следующей задачей исследования был анализ частоты обнаружения антител в трех группах участников. Результаты представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Частота обнаружения и титры антител в группах участников

Параметры	ОГС (n = 8)	ХГС		Достоверность различий
		без терапии (n = 25)	с терапией (n = 30)
Частота обнаружения, n (%)	6 (75,0 ± 16,4)	11 (44,0 ± 10,1)	18 (60,0 ± 9,1)	Р > 0,05 для всех групп
Титр доминирующий минорные	1:10 у 66,7% 1:20 и 1:80 в 2 образцах	1:10 у 72,7% 1:20 в 3 образцах	1:10 у 77,8% 1:20–1:80 в 4 образцах	Р > 0,05 для всех групп

 

Надо отметить, что во всех группах преобладающим титром был 1:10. Участники с ОГС чаще всего имели антитела к анализируемым пептидам. Однако, учитывая, что эта группа была самой малочисленной, данное заключение нуждается в подтверждении. Участники с ОГС были взяты на мониторинговое наблюдение, у двух из них доказана элиминация вируса длительным отсутствием РНК (3–4 года). У одного из этих двух участников титры антител к трем пептидам были 1:80 (I) и 1:160 (II и III). У второго участника были обнаружены антитела только к II и III пептиду в титре 1:10, а также к нуклеокапсидному антигену в этом же титре (в последнем случае использовали сертифицированную тест-систему «Бест анти-ВГС – спектр»). На протяжении всего периода наблюдения у данного участника не обнаруживались антитела к антигенам NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, что нетипично для ОГС. Вероятно, сказались иммунологические особенности данного участника.

В трех образцах участников без терапии были выявлены антитела к пептидам в титре 1:20, причем в каждом образце только к одному из пептидов. У участников, получавших ПППД, в шести образцах антитела были обнаружены в титрах от 1:20 до 1:80.

Следующей задачей был анализ взаимосвязи титра антител с результатом терапии. На рис. 2 представлены данные по частоте выявления антител у участников, достигших устойчивого вирусологического ответа (УВО), и участников, завершивших терапию без него.

 

Рис. 2. Частота обнаружения (в %) антител к трем пептидам у участников с разным результатом лечения

 

Достоверных различий в частоте выявления антител к какому-либо одному из трех пептидов у участников, достигших УВО или завершивших терапию без него, нет.

Следующей задачей был анализ ассоциации между достижением УВО и наличием антител к одному или нескольким пептидам одновременно. Результаты этого анализа представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Анализ взаимосвязи между достижением УВО и наличием антител к пептидам

Наличие антител	Участники с УВО (n = 18)	Участники без УВО (n = 12)	Достоверность различий
К одному пептиду, % (n)	5,6 ± 5,5 (1)	66,7±15,1 (8)	Р = 0,0086
К двум пептидам, % (n)	38,9 ± 11,8 (7)	0 (0)	Р = 0,0242
К трем пептидам, % (n)	16,7 ± 9,0 (3)	8,3 ± 8,3 (1)	Р = 0,6315

 

Как следует из данных табл. 2, наличие антител только к одному пептиду характерно для участников, не достигших УВО (достоверная ассоциация); к двум пептидам – для участников, достигших УВО (достоверная ассоциация). Логично было бы ожидать, что наличие антител к трем пептидам тоже должно быть ассоциировано с достижением УВО, но малочисленность группы и тот факт, что участник, имеющий антитела к трем пептидам, не достиг УВО из-за того, что прервал курс терапии, нарушило взаимосвязь.

Относительно титров антител к пептидам обнаружены интересные закономерности. В исследовании участвовали 10 человек с ХГС в цирротической стадии, 3 из них достигли УВО, 7 – нет. У 6 из 7 участников без УВО титр антител составил 1:10, а у 1 участника титр к пептиду I был 1:80. Этот участник почти достиг УВО (РНК ВГС отсутствовала на 5-м месяце после окончания терапии, но на 6-м месяце она была обнаружена). У 1 участника с УВО титр антител к пептиду II был 1:80, и у него уже 5 лет не выявляется РНК. Можно предположить, что титр 1:80 ассоциирован с достижением УВО или элиминацией вируса при ОГС. Вероятно, правомерно и противоположное заключение: наличие антител в титре меньше 1:80 ассоциировано с недостижением УВО и хронизацией ВГС в острой фазе инфекции.

Обсуждение результатов

Синтезированный пептид I воспроизводил область белка Е1 с а. о. 244–259, которую ранее A. Zibert c соавт. оценили как иммунологически значимую с частотой обнаружения антител от 11 до 46% в зависимости от групп инфицированных участников [15]. Ранее было показано, что область 242–261 а. о. белка Е1 участвует в связывании ВГС с клетками HepG2 [16]. В аминокислотной последовательности 244–260 а. о. белка Е1 ВГС есть сходство с участком 344–362 а. о. оболочечного белка Е вируса клещевого энцефалита, еще одного представителя семейства Flaviviridae [17]. В нашем исследовании антитела к пептиду I выявлялись в 25,8 ± 5,4% образцов, и это самый низкий результат относительно двух других пептидов, что свидетельствует о невысокой иммуногенности этой области белка Е1.

Пептид II моделирует область В-клеточного эпитопа, имеющего высококонсервативную аминокислотную последовательность, антитела к которой вызывают межгенотипную перекрестную нейтрализацию [18]. Анализируя область 311–330 а. о. (близкую к нашему пептиду II), A. Zibert c соавт. показали, что антитела к ней выявляются в зависимости от групп инфицированных участников с частотой 39–58% [14]. В нашем исследовании антитела к пептиду II были выявлены наиболее часто среди всех трех пептидов – в 39,7 ± 6,2% образцов.

Пептид III представлял собой вариант консенсусной последовательности С-концевой области HVR1. Близкую область (384–395 а. о.) анализировали A. Zibert c соавт., которые показали, что 39% сывороток инфицированных имеют антитела к этой области [15]. Наши данные близки результату A. Zibert c соавт. Известно, что участок 396–407 а. о. входит в область контакта с рецептором CD81 и на него образуются ВНА [19].

Таким образом, два из трeх проанализированных пептидов воспроизводили участки, на которые образуются ВНА, один – участок связывания с гепатомной клеточной линией HepG2. Поэтому данные пептиды могут рассматриваться как кандидаты на включение в разработку вакцины от гепатита С. Наличие антител к пептидам может быть прогностическим признаком. Наличие антител только к одному пептиду было характерно для пациентов, не достигших УВО (Р = 0,0086). Если выявлялись антитела к двум пептидам, то этот факт был ассоциирован с достижением УВО (Р = 0,0242). Еще одно потенциальное значение наличия антител к этим пептидам заключается в том, что, если антитела к ним имеют титр 1:80 и выше, то это позитивный прогностический маркер для терапии ПППД и элиминации ВГС в острой фазе инфекции.

Заключение

В представленном исследовании показано, что три химически синтезированных пептида из оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС выявляли антитела у участников как с острым, так и с хроническим гепатитом С. Около половины образцов сывороток (55,6 ± 6,3%) имели антитела к этим пептидам, но в большинстве проб титры были низкими – 1:10. Наиболее высокий титр составил 1:160 и был обнаружен у участника с ОГС, у которого гепатит завершился элиминацией вируса. Все участники с титром 1:80 (кроме одного) завершили терапию ПППД с достижением УВО. Чаще всего антитела регистрировались к пептиду II, воспроизводящему консервативный иммунодоминантный В-эпитоп белка Е1. Данные три пептида могут рассматриваться как кандидаты на включение в разработку вакцины от гепатита С. Вероятно, наличие антител к этим пептидам в титре 1:80 и выше имеет позитивное прогностическое значение для оценки исхода ОГС и терапии ПППД. Наличие антител только к одному пептиду (любому) было характерно для участников, завершивших терапию без УВО. Если были выявлены антитела к двум пептидам, то участники достоверно чаще достигали УВО.

About the authors

Maya D. Stuchinskaya

MIREA - Russian Technology University; N. F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: mayastaya@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8544-7482

Graduate Student; Junior Researcher

Russian Federation, Moscow; Moscow

Lyudmila I. Nikolaeva

N. F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: l.i.nikolaeva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1323-5568

Doctor of Sciences in Biology, Leading Researcher

Russian Federation, Moscow

Nadezhda G. Shevchenko

N. F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: dr.nadya@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-2486-4554

Junior Researcher

Russian Federation, Moscow

Georgy V. Sapronov

N. F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology; Russian Medical Academy of Continuing Professional Education

Email: g-sapronov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2154-2904

Candidate of Sciences in Medicine, Senior Researcher; Associate Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Natalya S. Shastina

MIREA - Russian Technology University

Email: inosit@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8382-7262

Candidate of Sciences in Chemistry, Associate Professor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files