Application of IR-spectrometry and independent component analisys for the quantitative determination of ademethionine in tablets

Full Text

Введение.

S-аденозил-L-метионин является универсальным коферментом, присутствующим во всех живых клетках. Он играет ключевую роль в клеточной биохимии и участвует в трех фундаментальных метаболических процессах таких как метилирование, аминопропилирование и транссульфурация. [1]. Адеметионин нашел широкое применение в медицине в качестве гепатопротектора [2]. Также клиническая эффективность адеметионина изучалась в рамках комплексной терапии различных патологических состояний, таких как депрессивные расстройства [3], лечение остеортрита и улучшение функциональной активности суставов [4].

Инфракрасная спектрометрия в режиме нарушенного полного внутреннего отражения представляет собой усовершенствованный вариант традиционной ИК-спектрометрии, который позволяет проводить анализ различных объектов аналитического контроля без длительной пробоподготовки. Метод основан на регистрации спектров, получаемых в результате взаимодействия ИК-излучения с поверхностным слоем образца, находящегося в непосредственном контакте с кристаллом с высоким значением показателя преломления (алмаз, селенид цинка). Однако из-за наложения спектральных полос, наличия фоновых и матричных искажений прямая интерпретация ИК-спектров, основанная на визуальной оценке или однофакторном анализе, оказывается недостаточно информативной и затруднённой. В таких случаях применяются хемометрические методы — совокупность математико-статистических подходов, направленных на извлечение значимой аналитической информации из многомерных спектральных данных.

Метод независимых компонент (Independent Component Analysis, ICA) — это статистический метод обработки сигналов, позволяющий выделять отдельные источники из их линейной смеси. Метод основан на поиске линейного представления негауссовых данных таким образом, чтобы компоненты были максимально статистически независимы [5]. Метод независимых компонент нашел применение для решения задач количественного анализа в комбинации с различными спектроскопическими методами, включая УФ-, ИК-, флуоресцентную и ЯМР-спектроскопию [6-11].

Для количественного определения адеметионина в лекарственных средствах применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза [12, 13]. Однако ввиду наличия определенных ограничений данных методов, имеет место разработка новых подходов к количественному определению адеметионина в лекарственных препаратах, отвечающих современным трендам в аналитической и фармацевтической химии (принципы «зеленой химии», достаточный уровень точности и экспрессности).

Целью настоящей работы является оценка метрологических характеристик методики количественного определения адеметионина в таблетках методом ИК-спектрометрии в режиме нарушенного полного внутреннего отражения с применением метода независимых компонент.

Материалы и методы. Для выполнения исследования использовался лекарственный препарат «Гептрал», таблетки кишечнорастворимые, покрытые пленочной оболочкой, 500 мг (ЭббВи С.р.л., Италия), фармацевтическая субстанция адеметионина 1,4-бутандисульфонат (Med.Chem. Express LLC) (далее — АБ) и вспомогательные вещества, представленные в таблице 1.

Таблица 1 / Table 1

Состав лекарственного препарата «Гептрал» и матрицы

Composition of the Medicinal Product "Heptral" and the Matrix

Наименование	Тип	Состав
Лекарственный препарат «Гептрал», таблетки кишечнорастворимые, покрытые пленочной оболочкой, 500 мг (производитель - ЭббВи С.р.л., Италия)	Фармацевтическая субстанция	Адеметионина 1,4-бутандисульфонат 949 мг, что соответствует содержанию адеметионина - 500 мг
	Вспомогательные вещества	Кремния диоксид коллоидный – 5,50 мг.
		Целлюлоза микрокристаллическая – 118,00 мг.
		Карбоксиметилкрахмал натрия (тип А) – 22,00 мг.
		Магния стеарат – 5,50 мг.
		Метакриловой кислоты и этилакрилата сополимер (1:1) – 32,63 мг.
		Макрогол 6000 – 9,56 мг.
		Полисорбат-80 – 0,52 мг.
		Симетикон эмульсия (30%) – 0,40 мг.
		Натрия гидроксид – 0,44 мг
		Тальк – 21,77 мг
Матрица (на 100 г смеси)	Вспомогательные вещества	Кремния диоксид коллоидный – 3,18 г.
		Целлюлоза микрокристаллическая – 68,30 г.
		Карбоксиметилкрахмал натрия (тип А) – 12,73 г.
		Тальк – 12,6 г
		Магния стеарат – 3,18 г.

Для измерения массы использовались аналитические весы Sartorius Practum 124–1ORU (Германия). ИК-спектры регистрировали с помощью ИК-Фурье спектрометра Agilent Cary 630 FTIR (со специальной приставкой для работы в режиме нарушенного полного внутреннего отражения, кристалл – алмаз) в диапазоне волновых чисел от 4000 до 650 см^-1 с разрешением 4 см^-1, число сканов - 10.  Обработка ИК-спектров осуществлялась в программном обеспечении Agilent Microlab Expert 1.0.0.7 (регистрация ИК-спектров, ATR-коррекция) и KNIME 5.3.2 с предустановленными модулями Python 3.9.7.

Для разработки математической модели, основанной на методе независимых компонент, все полученные ИК-спектры нормализовали (Min-Max нормализация, в диапазоне значений от 0 до 1), к нормализованным данным применяли коррекцию базовой линии полиномами 1-4 порядка. Далее полученные данные разделяли методом Кеннарда-Стоуна в соотношении 80/20 (обучающая выборка/валидационная выборка) и осуществляли подбор оптимального количества компонент (гиперпараметр). Расчёт проводили с помощью алгоритма FastICA. Общий дизайн эксперимента представлен на рисунке 1.

В ходе работы было оценено влияние коррекции базовой линии на результат прогноза математической модели.  В качестве основных метрик для оценки качества модели использовали среднеквадратичный остаток калибровки (RMSEC, 1), среднеквадратичный остаток прогноза (RMSEP, 2), коэффициент детерминации на валидационной выборке (r², 3) и сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрёстной проверки с поочередным исключением (PRESS_LOO, 4).

,

(1)

где N_c – число проб обучающей выборки;

y_i – известное содержание АБ в пробе, %;

ŷ_i – массовая доля АБ, полученная по калибровочной модели из обучающей выборки, %.

,

(2)

где N_p – число проб валидационной выборки;

y_i – известное содержание АБ в пробе, %;

ŷ_i – массовая доля АБ, полученная по калибровочной модели, %.

(3)

где N_p – число проб валидационной выборки;

y_i – известное содержание АБ в пробе, %;

ȳ_i – среднее значение массовой доли АБ, %.

ŷ_i – массовая доля АБ, полученная по калибровочной модели, %.

(4)

где N – общее число проб;

y_i – известное содержание АБ в пробе, %;

ŷ_i – массовая доля АБ, рассчитанная с помощью перекрёстной проверки калибровочной модели с поочередным исключением, %.

Величина RMSEC, рассчитанная по обучающей выборке, характеризует насколько хорошо модель представляет известные данные при описании регрессионной зависимости. Значение RMSEP оценивает предсказательную способность модели на тестовом наборе данных. Меньшая разница между RMSEC и RMSEP демонстрирует, что модель не подвержена переобучению и обладает достаточной прогнозирующей способностью для расчета концентрации АБ в пробе.

Для разработки математической модели, основанной на методе независимых компонент, было получено 50 спектров смесей АБ с матрицей в диапазоне концентраций основного действующего вещества от 50 % до 100%. Приготовление смесей проводили перетиранием в ступке фармацевтической субстанции с матрицей в различных соотношениях до получения однородной массы.

Рисунок 1. – Дизайн эксперимента.

Figure 1. Experimental design.

Результаты и их обсуждение. ИК-спектр АБ существенно отличается положением и интенсивностью полос поглощения от ИК-спектров матрицы и таблеток «Гептрал» (рисунок 2).

Для последующей разработки математической модели, основанной на методе независимых компонент, была выбрана область волновых чисел в диапазоне от 1800 до 650 см^-1, содержащая характеристические полосы поглощения валентных (C=O) колебаний карбоксильной группы (1685 cм^-1), валентных (S=O) колебаний бутандисульфоната (1130 cм^-1), валентных колебаний (-S⁺-CH₃) метилсульфониевого фрагмента адеметионина (1020 см^-1) и область «отпечатков пальцев».

Рисунок 2. – Различия ИК-спектров, зарегистрированных в режиме нарушенного полного внутреннего отражения: «Гептрал», таблетки кишечнорастворимые, покрытые пленочной оболочкой, 500 мг.; матрица; адеметионин 1,4-бутандисульфонат (фармацевтическая субстанция).

Figure 2. Differences in the infrared spectra recorded in the attenuated total reflection mode: "Heptral", enteric-coated tablets, 500 mg; matrix; ademetionine 1,4-butanedisulfonate (pharmaceutical substance).

Для выбора оптимальной модели с лучшими прогнозирующими характеристиками нами изучено влияние коррекции базовой линии (без коррекции или полиномиальная коррекция 1-4 порядков) на точность прогноза моделей (RMSEC, RMSEP, r², PRESS_LOO). На рисунке 3 представлено исследование зависимости влияния количества независимых компонент на среднеквадратичный остаток калибровки, среднеквадратичный остаток прогноза, коэффициент детерминации и сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрёстной проверки с поочередным исключением для различных вариантов коррекции базовой линии.

Рисунок 3. – Влияние количества компонент на среднеквадратичный остаток калибровки (A), среднеквадратичный остаток прогноза (B), коэффициент детерминации (C) и сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрёстной проверки с поочередным исключением (D) в зависимости от варианта коррекции базовой линии.

Figure 3. Effect of the number of components on the root mean square error of calibration (A), root mean square error of prediction (B), coefficient of determination (C), and the predicted residual sum of squares from leave-one-out cross-validation (D) for different baseline correction methods.

Коэффициент детерминации (r²) для тестового набора данных превышает значение 0,99 для всех моделей с любым вариантом коррекции базовой линии при применении 6 компонент и более. Наименьшие значения среднеквадратичного остатка калибровки и среднеквадратичного остатка прогноза достигаются при использовании 10 компонент в вариантах коррекции базовой линии полиномом 3 порядка – 0,343 и 0,172, и коррекции базовой линии полиномом 4 порядка – 0,332 и 0,174 соответственно (таблица 2). Для оценки недообучения и переобучения регрессионной модели использовали сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрёстной проверки с поочередным исключением (PRESS_LOO). Значения PRESS_LOO  для разных вариантов коррекции базовой линии сопоставимы между собой в оптимальных вариантах моделей.

Известно, что одним из ключевых эмпирических правил в хемометрике является правило «правило достаточной точности» [14]. Согласно этому правилу, необходимо выбирать число факторов (латентных переменных, компонент) так, чтобы предсказательная точность модели была достаточной для практического применения, но без переобучения.  Таким образом, окончательный выбор параметров модели для количественного определения адеметионина в таблетках был осуществлен на основе исследования метрологических характеристик математических моделей, представленных в таблице 3.  

Таблица 2/ Table 2

Оптимальные значения числа компонент и характеристики математических моделей для количественного определения адеметионина 1,4-бутандисульфоната в таблетках

Optimal Number of Components and Characteristics of the Mathematical Models for Quantification of Ademetionine 1,4-butanedisulfonate in Tablets

Характеристика	Без коррекции базовой линии	Коррекция базовой линии (полином 1 порядка)	Коррекция базовой линии (полином 2 порядка)	Коррекция базовой линии (полином 3 порядка)	Коррекция базовой линии (полином 4 порядка)
Наименование	Модель 1	Модель 2	Модель 3	Модель 4	Модель 5
Оптимальное количество компонент	7	9	10	10	10
RMSEC	0,698	0,566	0,351	0,343	0,332
RMSEP	0,323	0,257	0,187	0,172	0,174
r2	0,999	0,999	0,999	0,999	0,999
PRESSLOO	35,0	35,4	33,1	31,6	30,2

 

Таблица 3 / Table 3

Сравнение метрологических характеристик предлагаемых математических моделей для аналитической методики количественного определения адеметионина 1,4-бутандисульфоната в таблетках

Comparison of the Metrological Characteristics of the Proposed Mathematical Models for the Analytical Procedure of Ademetionine 1,4-butanedisulfonate Quantification in Tablets

Модель	µ	f	x̄	s		P, %	t(P,f)	Δx	Δx̄
1	81,4	10	82,3	1,12	0,37	95	2,228	2,49	0,75	0,91
2	81,4	10	81,6	1,21	0,36	95	2,228	2,69	0,81	0,99
3	81,4	10	81,5	1,22	0,37	95	2,228	2,71	0,82	1,00
4	81,4	10	81,7	1,21	0,36	95	2,228	2,69	0,81	0,99
5	81,4	10	81,7	1,21	0,36	95	2,228	2,69	0,81	0,99

Условные обозначения: µ –   истинное (принятое опорное) значение содержания АБ, масс. %; f – число степеней свободы; x̄ – среднее значение рассчитанного содержания АБ, масс. %; s – стандартное отклонение;  – стандартное отклонение среднего результата; P – доверительная вероятность, %; t(P, f) – критерий Стьюдента; Δx – полуширина доверительного интервала единичного определения, масс.%; Δx̄ – полуширина доверительного интервала среднего результата, масс.%; ε̅ – относительная ошибка среднего результата, %.

Сравнительный анализ метрологических характеристик моделей (таблица 2, 3) показал, что модель без коррекции базовой линии (число компонент – 7) является наиболее предпочтительной. Данная модель обладает удовлетворительными характеристиками при меньшей сложности в сравнении с более сложными вариантами с коррекцией базовой линии полиномами 1-4 порядков. Усложнение математических моделей не привело к существенному улучшению метрологических характеристик.

Оценку мультиколлинеарности между независимыми компонентами результирующей модели исследовали с помощью коэффициента корреляции Пирсона на общем наборе данных. Коэффициент корреляции между независимыми компонентами находился в диапазоне от 0,007 до 0,130, что говорит об отсутствие линейной связи между ними (таблица 4).

Таблица 4 / Table 4

Оценка мультиколлинеарности разработанной математической модели для количественного определения адеметионина 1,4-бутандисульфоната

Evaluation of multicollinearity in the proposed mathematical model for quantifying ademethionine 1,4-butanedisulfonate

Номер компоненты	1	2	3	4	5	6	7
1	1,000	-0,007	0,048	-0,015	0,026	-0,039	0,040
2	-0,007	1,000	-0,021	-0,081	-0,070	-0,014	0,064
3	0,048	-0,021	1,000	-0,038	0,051	-0,034	0,032
4	-0,015	-0,081	-0,038	1,000	-0,009	0,029	-0,130
5	0,026	-0,070	0,051	-0,009	1,000	-0,029	0,055
6	-0,039	-0,014	-0,034	0,029	-0,029	1,000	-0,021
7	0,040	0,064	0,032	-0,130	0,055	-0,021	1,000

Анализ нормализованных вкладов независимых компонент в реконструированный спектральный профиль позволяет выделить основные статистически независимые источники аналитического сигнала [15]. На рисунке 4 представлено распределение нормализованных вкладов независимых компонент по частотам в формировании ИК-спектров. В таблице 5 показана связь между характеристическими полосами и независимыми компонентами, вносящими наибольший вклад в формирование сигнала, а также соответствие максимальных абсолютных значений нормализованных вкладов независимых компонент функциональным группам веществ, присутствующим в смеси. Критерием влияния компоненты на характеристическую частоту служила абсолютная величина нормализованного вклада более чем 0,5.   

Рисунок 4 – Анализ нормализованных вкладов независимых компонент в реконструированный спектральный профиль

Figure 4. Analysis of the normalized contributions of independent components to the reconstructed spectral profile.

Таблица 5 / Table 5

Таблица нормализованных вкладов независимых компонент в формирование спектра

Table of normalized contributions of independent components to spectrum formation

Полоса (см⁻¹)	Возможные функциональные группы	Возможные компоненты смеси	Наименование компоненты
718	C-H2 деформационный колебание	Магния стеарат	IC2, IC4, IC5, IC6, IC7
788	Si–O валентные колебания	Тальк	IC6
830	C–O–С деформационные колебания	МКЦ, КМК	IC4, IC6
886	C–O–C валентные колебания	МКЦ, КМК	IC4, IC5, IC6
984	C–H2 деформационные колебания, S+-CH3 (адеметионин)	МКЦ, КМК, АБ	IC1, IC3, IC5, IC6
1054	C–O валентные колебания, C–N валентные колебания	МКЦ, КМК, АБ	IC2, IC3
1088	C–O–C валентные колебания, SO₃⁻ валентные колебания, Si–O валентные колебания	МКЦ, КМК, АБ, тальк	IC3, IC4, IC6, IC7
1120	C–O–C валентные колебания, S=O валентные колебания	МКЦ, КМК, АБ	IC2, IC4, IC6, IC7
1200	COO⁻ валентные колебания, SO₃⁻ валентные колебания	КМК, АБ	IC2
1600	COO⁻ валентные колебания	КМК, АБ	IC4
1680	C=O валентные колебания	АБ, частично КМК	IC2, IC4, IC6

Условные обозначения: МКЦ — целлюлоза микрокристаллическая, КМК — карбоксиметилкрахмал натрия

Таким образом, выявлена связь наиболее значимых характеристических полос поглощения веществ, входящих в состав смеси, и их влияние на регрессионную модель.

Заключение. Показана возможность применения метода независимых компонент в количественном определении адеметионина в таблетках методом ИК-спектрометрии в режиме нарушенного полного внутреннего отражения с предварительной хемометрической обработкой аналитического сигнала. Выбраны оптимальные параметры математической модели (количество компонент, вид коррекции базовой линии). Относительная погрешность среднего результата для полученной модели составила менее 1%, Проведена интерпретация весов независимых компонент и их связь с характеристическими частотами.    

About the authors

Irina V. Kachalkina

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: i.v.sokolova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4871-5868

Senior specialist, Scientific and educational center “Pharmacy”.

Russian Federation, Samara

Tatyana K. Ryazanova

Samara State Medical University

Email: t.k.ryazanova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-4581-8610

Dr. Sci. (Pharmacy), Professor, Director of the Scientific and educational center “Pharmacy”.

Russian Federation, Samara

Maksim N. Kachalkin

Samara State Medical University

Email: m.n.kachalkin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4356-9435

Cand. Sci. (Pharmacy), Senior specialist, Scientific and educational center “Pharmacy”.

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files