Application of IR-spectrometry and independent component analisys for the quantitative determination of ademethionine in tablets

Full Text

Список сокращений

АБ – адеметионин 1,4-бутандисульфонат; МКЦ – целлюлоза микрокристаллическая; КМК –карбоксиметилкрахмал натрия.

ВВЕДЕНИЕ

S-аденозил-L-метионин является универсальным коферментом, присутствующим во всех живых клетках. Он играет ключевую роль в клеточной биохимии и участвует в трех фундаментальных метаболических процессах, таких как метилирование, аминопропилирование и транссульфурация [1]. Адеметионин нашел широкое применение в медицине в качестве гепатопротектора [2]. Также клиническая эффективность адеметионина изучалась в рамках комплексной терапии различных патологических состояний, таких как депрессивные расстройства [3], лечение остеоартрита и улучшение функциональной активности суставов [4].

Инфракрасная спектрометрия в режиме нарушенного полного внутреннего отражения представляет собой усовершенствованный вариант традиционной ИК-спектрометрии, который позволяет проводить анализ различных объектов аналитического контроля без длительной пробоподготовки. Метод основан на регистрации спектров, получаемых в результате взаимодействия ИК-излучения с поверхностным слоем образца, находящегося в непосредственном контакте с кристаллом с высоким значением показателя преломления (алмаз, селенид цинка). Однако из-за наложения спектральных полос, наличия фоновых и матричных искажений прямая интерпретация ИК-спектров, основанная на визуальной оценке или однофакторном анализе, оказывается недостаточно информативной и затрудненной. В таких случаях применяются хемометрические методы – совокупность математико-статистических подходов, направленных на извлечение значимой аналитической информации из многомерных спектральных данных.

Метод независимых компонент (Independent Component Analysis, ICA) – это статистический метод обработки сигналов, позволяющий выделять отдельные источники из их линейной смеси. Метод основан на поиске линейного представления негауссовых данных таким образом, чтобы компоненты были максимально статистически независимы [5]. Метод независимых компонент нашел применение для решения задач количественного анализа в комбинации с различными спектроскопическими методами, включая УФ-, ИК-, флуоресцентную и ЯМР-спектроскопию [6–11].

Для количественного определения адеметионина в лекарственных средствах применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза¹ [12]. Однако эти методы в случае анализа субстанции и препаратов адеметионина имеют ряд методологических и практических ограничений в связи с его высокой полярностью, ионной природой, ограниченной стабильностью в водных растворах и чувствительностью к изменению рН. В частности, для удерживания вещества на обращенно-фазовых колонках требуется применение ион-парных реагентов (например, натрия октансульфоната), что усложняет состав подвижной фазы, снижает воспроизводимость и требует более тщательной регенерации колонки. Кроме того, адеметионин склонен к деградации (например, с образованием S-аденозилгомоцистеина), что требует строгого контроля условий анализа (pH, температура, время пробоподготовки), увеличивая риск систематических ошибок [13]. Основной проблемой использования метода капиллярного электрофореза является высокая чувствительность к матричным эффектам и составу буферного раствора. В сложных лекарственных формах наличие вспомогательных веществ может существенно влиять на электрофоретическую подвижность аналита, приводя к ухудшению разрешения и воспроизводимости. Кроме того, для адеметионина, как многозарядного и лабильного соединения, требуется строгий контроль pH и ионной силы буфера, что усложняет разработку аналитической методики.

В связи с этим актуальным является разработка новых подходов к количественному определению адеметионина в лекарственных препаратах, отвечающих современным трендам в аналитической и фармацевтической химии (принципы «зеленой химии», достаточный уровень точности и экспрессности). Использование ИК-спектрометрии в сочетании с хемометрическими методами, в частности методом регрессии на независимые компоненты, приобретает ряд преимуществ. Несмотря на традиционное ограничение, связанное с наложением спектральных полос, применение многомерных методов обработки данных позволяет разделять вклад отдельных компонентов без необходимости их физического разделения.

ЦЕЛЬ

Оценка метрологических характеристик методики количественного определения адеметионина в таблетках методом ИК-спектрометрии в режиме нарушенного полного внутреннего отражения с применением метода независимых компонент.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для выполнения исследования использовался лекарственный препарат «Гептрал», таблетки кишечнорастворимые, покрытые пленочной оболочкой, 500 мг (ЭббВи С.р.л., Италия), фармацевтическая субстанция адеметионина 1,4-бутандисульфонат (Med.Chem. Express LLC) (далее – АБ) и вспомогательные вещества, представленные в таблице 1. Матрица была составлена с учетом массовой доли компонентов и максимально приближена к составу препарата «Гептрал», что позволяет учитывать спектральные особенности основных компонентов и снижает влияние матричных эффектов. При формировании состава матрицы не учитывали вспомогательные вещества, присутствующие в низких концентрациях (менее 5% масс.). Вещества с содержанием менее 5% масс. формируют слабые, плохо воспроизводимые полосы, не влияющие существенно на регрессионную модель, их вклад сопоставим с уровнем шумов и вариаций базовой линии [14, 15].

Для измерения массы использовались аналитические весы Sartorius Practum 124–1ORU (Германия). Пробоподготовку образцов проводили в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0002 «Спектрометрия в средней инфракрасной области». ИК-спектры регистрировали с помощью ИК-Фурье спектрометра Agilent Cary 630 FTIR (со специальной приставкой для работы в режиме нарушенного полного внутреннего отражения, кристалл – алмаз) в диапазоне волновых чисел от 4000 до 650 см^-1 с разрешением 4 см^-1, число сканов – 10. Обработка ИК-спектров осуществлялась в программном обеспечении Agilent Microlab Expert 1.0.0.7 (регистрация ИК-спектров, ATR-коррекция) и KNIME 5.3.2 с предустановленными модулями Python 3.9.7.

Для разработки математической модели, основанной на методе независимых компонент, была выбрана область ИК-спектра 1800-650 см^-1, содержащая основные характеристические полосы поглощения адеметионина. Все полученные ИК-спектры нормализовали (Min-Max нормализация, в диапазоне значений от 0 до 1), к нормализованным данным применяли коррекцию базовой линии полиномами 1–4 порядка. Далее полученные данные разделяли методом Кеннарда – Стоуна в соотношении 80/20 (обучающая выборка/валидационная выборка) и осуществляли подбор оптимального количества компонент (гиперпараметр). Расчет проводили с помощью алгоритма FastICA. Общий дизайн эксперимента представлен на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Дизайн эксперимента.

Figure 1. Experimental design.

 

В ходе работы было оценено влияние коррекции базовой линии на результат прогноза математической модели. В качестве основных метрик для оценки качества модели использовали среднеквадратичный остаток калибровки (RMSEC, 1), среднеквадратичный остаток прогноза (RMSEP, 2), коэффициент детерминации на валидационной выборке (r², 3) и сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрестной проверки с поочередным исключением (PRESS_LOO, 4) [16, 17].

$RMSEC=\sqrt{\frac{1}{N_c}\sum _{j=1}^{N_c}{\left({\hat{y}}_j-y_j\right)}^2},$ , (1)

где N_c – число проб обучающей выборки; yi – известное содержание АБ в пробе, %; ŷi – массовая доля АБ, полученная по калибровочной модели из обучающей выборки, %.

$RMSEP=\sqrt{\frac{1}{N_p}\sum _{j=1}^{N_p}{\left({\hat{y}}_j-y_j\right)}^2}$ , (2)

где N_p – число проб валидационной выборки; yi – известное содержание АБ в пробе, %; ŷ_i – массовая доля АБ, полученная по калибровочной модели, %.

$r^2=1-\frac{{\sum }_{j=1}^{N_p}{\left(y_j-{\hat{y}}_l\right)}^2}{{\sum }_{j=1}^{N_p}{\left(y_j-{\overline{y}}_l\right)}^2}$, (3)

где N_p – число проб валидационной выборки; y_i – известное содержание АБ в пробе, %; ȳ_i – среднее значение массовой доли АБ, %. ŷ_i – массовая доля АБ, полученная по калибровочной модели, %.

$RRES{S}_{LOO}=\sum _{i=1}^N{\left(y_i-{\hat{y}}_l\right)}^2$ , (4)

где N – общее число проб; y_i – известное содержание АБ в пробе, %; ŷ_i – массовая доля АБ, рассчитанная с помощью перекрестной проверки калибровочной модели с поочередным исключением, %.

Величина RMSEC, рассчитанная по обучающей выборке, характеризует, насколько хорошо модель представляет известные данные при описании регрессионной зависимости. Значение RMSEP оценивает предсказательную способность модели на тестовом наборе данных. Меньшая разница между RMSEC и RMSEP демонстрирует, что модель не подвержена переобучению и обладает достаточной прогнозирующей способностью для расчета концентрации АБ в пробе.

Для разработки математической модели, основанной на методе независимых компонент, было получено 50 спектров смесей АБ с матрицей в диапазоне концентраций основного действующего вещества от 50% до 100%. Приготовление смесей проводили перетиранием в ступке фармацевтической субстанции с матрицей в различных соотношениях до получения однородной массы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ИК-спектр АБ существенно отличается положением и интенсивностью полос поглощения от ИК-спектров матрицы и таблеток «Гептрал» (рисунок 2).

 

Рисунок 2. Различия ИК-спектров, зарегистрированных в режиме нарушенного полного внутреннего отражения: «Гептрал», таблетки кишечнорастворимые, покрытые пленочной оболочкой, 500 мг.; матрица; адеметионин 1,4-бутандисульфонат (фармацевтическая субстанция).

Figure 2. Differences in the infrared spectra recorded in the attenuated total reflection mode: “Heptral”, enteric-coated tablets, 500 mg; matrix; ademethionine 1,4-butanedisulfonate (pharmaceutical substance).

 

Для последующей разработки математической модели, основанной на методе независимых компонент, была выбрана область волновых чисел в диапазоне от 1800 до 650 см^-1, содержащая характеристические полосы поглощения валентных (C=O) колебаний карбоксильной группы (1685 cм^-1), валентных (S=O) колебаний бутандисульфоната (1130 cм^-1), валентных колебаний (-S⁺-CH₃) метилсульфониевого фрагмента адеметионина (1020 см^-1) и область «отпечатков пальцев».

Для выбора оптимальной модели с лучшими прогнозирующими характеристиками нами изучено влияние коррекции базовой линии (без коррекции или полиномиальная коррекция 1–4 порядков) на точность прогноза моделей (RMSEC, RMSEP, r², PRESS_LOO). На рисунке 3 представлено исследование зависимости влияния количества независимых компонент на среднеквадратичный остаток калибровки, среднеквадратичный остаток прогноза, коэффициент детерминации и сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрестной проверки с поочередным исключением для различных вариантов коррекции базовой линии.

 

Рисунок 3. Влияние количества компонент на среднеквадратичный остаток калибровки (A), среднеквадратичный остаток прогноза (B), коэффициент детерминации (C) и сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрестной проверки с поочередным исключением (D) в зависимости от варианта коррекции базовой линии.

Figure 3. Effect of the number of components on the root mean square error of calibration (A), root mean square error of prediction (B), coefficient of determination (C), and the predicted residual sum of squares from leave-one-out cross-validation (D) for different baseline correction methods.

 

Коэффициент детерминации (r²) для тестового набора данных превышает значение 0,99 для всех моделей с любым вариантом коррекции базовой линии при применении 6 компонент и более. Наименьшие значения среднеквадратичного остатка калибровки и среднеквадратичного остатка прогноза достигаются при использовании 10 компонент в вариантах коррекции базовой линии полиномом 3 порядка – 0,343 и 0,172 и коррекции базовой линии полиномом 4 порядка – 0,332 и 0,174 соответственно (таблица 2). Для оценки недообучения и переобучения регрессионной модели использовали сумму квадратов прогнозируемых остатков по результатам перекрестной проверки с поочередным исключением (PRESS_LOO). Значения PRESS_LOO для разных вариантов коррекции базовой линии сопоставимы между собой в оптимальных вариантах моделей.

Известно, что одним из ключевых эмпирических правил в хемометрике является «правило достаточной точности» [18]. Согласно этому правилу, необходимо выбирать число факторов (латентных переменных, компонент) так, чтобы предсказательная точность модели была достаточной для практического применения, но без переобучения. Таким образом, окончательный выбор параметров модели для количественного определения адеметионина в таблетках был осуществлен на основе исследования метрологических характеристик математических моделей, представленных в таблице 3.

Сравнительный анализ метрологических характеристик моделей (таблицы 2, 3) показал, что модель без коррекции базовой линии (число компонент – 7) является наиболее предпочтительной. Данная модель обладает удовлетворительными характеристиками при меньшей сложности в сравнении с более сложными вариантами с коррекцией базовой линии полиномами 1–4 порядков. Усложнение математических моделей не привело к существенному улучшению метрологических характеристик.

Оценку мультиколлинеарности между независимыми компонентами результирующей модели исследовали с помощью коэффициента корреляции Пирсона на общем наборе данных. Коэффициент корреляции между независимыми компонентами находился в диапазоне от 0,007 до 0,130, что говорит об отсутствии линейной связи между ними (таблица 4).

Анализ нормализованных вкладов независимых компонент в реконструированный спектральный профиль позволяет выделить основные статистически независимые источники аналитического сигнала [19]. На рисунке 4 представлено распределение нормализованных вкладов независимых компонент по частотам в формировании ИК-спектров. В таблице 5 показана связь между характеристическими полосами и независимыми компонентами, вносящими наибольший вклад в формирование сигнала, а также соответствие максимальных абсолютных значений нормализованных вкладов независимых компонент функциональным группам веществ, присутствующим в смеси. Критерием влияния компоненты на характеристическую частоту служила абсолютная величина нормализованного вклада более чем 0,5.

 

Рисунок 4. Анализ нормализованных вкладов независимых компонент в реконструированный спектральный профиль.

Figure 4. Analysis of the normalized contributions of independent components to the reconstructed spectral profile.

 

Таким образом, выявлена связь наиболее значимых характеристических полос поглощения веществ, входящих в состав смеси, и их влияние на регрессионную модель.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показана возможность применения метода независимых компонент в количественном определении адеметионина в таблетках методом ИК-спектрометрии в режиме нарушенного полного внутреннего отражения с предварительной хемометрической обработкой аналитического сигнала. Подобраны оптимальные параметры математической модели на основе метода регрессии на независимые компоненты для количественного определения адеметионина в таблетках (количество компонент – семь, без коррекции базовой линии). Относительная погрешность среднего результата для полученной модели составила менее 1%. Проведена интерпретация весов независимых компонент и их связи с характеристическими частотами.

 

Дополнительная информация	Additional information
Источник финансирования. Работа выполнена по инициативе авторов без привлечения финансирования.	Study funding. The work was carried out on the initiative of the authors without attracting funding.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.	Conflict of interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the content of this article.
Участие авторов. Качалкина И.В.: сбор и обработка материала, анализ данных, подготовка текста статьи. Рязанова Т.К.: редактирование текста статьи. Качалкин М.Н.: разработка концепции и дизайн исследования, анализ данных. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.	Contribution of individual authors. Kachalkina I.V.: data collection and processing, data analysis, article preparation. Ryazanova T.K.: article editing. Kachalkin M.N.: study concept development and design, data analysis. All authors gave their final approval of the manuscript for submission, and agreed to be accountable for all aspects of the work, implying proper study and resolution of issues related to the accuracy or integrity of any part of the work.
Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).	Statement of originality. No previously published material (text, images, or data) was used in this work.
Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима.	Data availability statement. The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work.
Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.	Generative AI. No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.
Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали 2 внешних рецензента.	Provenance and peer review. This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved 2 external reviewers.

 

¹ Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание [Электронный ресурс]. - 2.1. Фармацевтические субстанции синтетического происхождения: Фармакопейная статья ФС.2.1.0334 «Адеметионина бутандисульфонат»: утверждена приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377: введена в действие с 01.09.2023.

About the authors

Irina V. Kachalkina

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: i.v.sokolova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4871-5868

Senior specialist, Scientific and educational center “Pharmacy”.

Russian Federation, Samara

Tatyana K. Ryazanova

Samara State Medical University

Email: t.k.ryazanova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-4581-8610

Dr. Sci. (Pharmacy), Professor, Director of the Scientific and educational center “Pharmacy”.

Russian Federation, Samara

Maksim N. Kachalkin

Samara State Medical University

Email: m.n.kachalkin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4356-9435

Cand. Sci. (Pharmacy), Senior specialist, Scientific and educational center “Pharmacy”.

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files