The results of using the real-time PCR method for examination of the placental microbial landscape

Full Text

Список сокращений

ПРПО – преждевременный разрыв плодных оболочек; КВМ – качество взятия материала; ОБМ – общая бактериальная масса.

ВВЕДЕНИЕ

В современном акушерстве особенности плацентарной микробиоты и ее регулирующего влияния на беременность являются ключевым вопросом. Если в прошлом столетии считалось, что плацента, плодные оболочки и околоплодные воды в норме должны быть стерильными [1, 2], то уже в начале 2000-х годов появились работы, свидетельствующие о существовании уникального плацентарного микробиома [3, 4]. Было обнаружено, что плацентарные микробы могут быть имплантированы в плаценту через урогенитально-плацентарный, желудочно-кишечно-плацентарный и орально-плацентарный пути [5–8]. Анализ полости матки при гистерэктомиях также продемонстрировал ее нестерильность [9]. Микробиота плаценты и околоплодных вод может играть как положительную роль, подготавливая иммунную систему плода к внеутробному существованию, так и отрицательную, так как многие микроорганизмы ассоциированы с абортами, хориоамнионитом, преждевременным разрывом плодных оболочек, преждевременными родами и мертворождением [10–13]. Основными факторами, влияющими на микробиологию плаценты, являются ожирение, гестационный сахарный диабет, пробиотики и антибиотики во время беременности [12, 14, 15]. Научному миру еще предстоит разобраться в особенностях микробиоты фетоплацентарного комплекса и ее влиянии на развитие осложнений гестации, материнскую и перинатальную заболеваемость.

ЦЕЛЬ

C помощью метода ПЦР в режиме реального времени изучить микробный пейзаж плаценты при доношенной беременности при преждевременном разрыве плодных оболочек (ПРПО) в сравнении с интактным плодным пузырем.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на базе родильных отделений ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова г. Самары c января 2017 года до января 2020 года. В исследование были включены 43 беременных в сроке беременности 37–41 неделя. В основную группу вошли 24 пациентки с ПРПО, группу контроля составили 19 пациенток с интактными плодными оболочками.

Критерии включения в основную группу: срок беременности 37–41,6 недели, ПРПО, наличие показаний к кесареву сечению (неправильное положение или предлежание плода и/или рубец на матке после операции кесарева сечения).

Критерии включения в группу контроля: беременность 37–41,6 недели без отхождения околоплодных вод, плановое кесарево сечение (неправильное положение или предлежание плода и/или рубец на матке после операции кесарева сечения).

Критерии исключения: беременные, относящиеся к группе высокого риска, согласно порядку оказания помощи по профилю «Акушерство и гинекология» №572 от 01.11.2012, а именно: соматические или акушерские осложнения, такие как сахарный и гестационный диабет, повышенное артериальное давление, задержка внутриутробного развития, вагинальное кровотечение, предлежание плаценты, подозрение на макросомию плода, внутрипеченочный холестаз, многоплодная беременность, мекониальное окрашивание околоплодных вод, признаки острой инфекции и обострения хронической, наличие кольпита.

У пациенток выполнено исследование микробиоты плацент методом ПЦР-РВ, тест Фемофлор-16 (Lactobacillus spp., Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp. / Leptotrihia spp. / Fusobacterium spp., Megasphaera spp. / Veillonella spp. / Dialister spp., Lachnobacterium spp. / Clostridium spp., Mobiluncus spp. / Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma (urealyticum + parvum), Candida spp., Mycoplasma genitalis). Тест Фемофлор-16, который первоначально разработан для оценки микробиоты влагалища, был использован нами с целью оценки микробного состава плаценты, поскольку с помощью данной технологии возможен анализ биоты различных биотопов [16–19].

Забор образца плаценты проводился в стерильных условиях во время операции кесарева сечения. Плацента извлекалась, и в пределах операционного поля проводился забор образца. Посередине расстояния от места прикрепления пуповины до наиболее отдаленной точки края плаценты с помощью конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм отсекался стандартный образец ткани плаценты с захватом участка из глубины плаценты (с предварительным отсечением амниона, хорионической пластинки и децидуальной ткани с материнской стороны), который затем помещался в пробирку 1,5 мл «эппендорф» с транспортной средой (физиологический раствор или «Проба-Рапид» производства ООО «НПО ДНК-Технология»).

При анализе оценивалось качество взятия материала (КВМ), которое во всех случаях было адекватным (более 104 ГЭ/образце). Выполнялось определение общей бактериальной массы (ОБМ), так называемой лабораторной ОБМ (ОБМл), содержания Lactobacillus spp. и остальных вышеперечисленных видов, входящих в данную панель. Количественная оценка выявленных микроорганизмов приводилась как в абсолютных числах – количество ДНК искомого микроорганизма в образце, выраженное в ГЭ/мл и представленное в виде десятичного логарифма – lg, расчетная ОБМ (ОБМр) получалась из суммы абсолютного количества выявленных микроорганизмов в образце.

Статистический анализ. Обработку результатов исследования проводили с помощью программы Statistica 10.0, SPSS 13. Данные представлены следующим образом: абсолютные количества – в виде среднего десятичных логарифмов, сравнение абсолютного количества в группах выполнялось с помощью критерия Манна – Уитни. Частота выявления микроорганизмов представлена в процентах, а также в относительных процентах относительно лабораторной ОБМ. Количественные показатели с нормальным распределением представлены средним арифметическим (М) со стандартным отклонением (SD). Сравнение количественных признаков при нормальном распределении проводилось с помощью критерия Стьюдента. Анализ качественных признаков проводился с помощью таблиц сопряженности, с применением критерия Хи-квадрат либо двустороннего критерия Фишера. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Проведение исследования было одобрено на заседании комитета по биоэтике (протокол №207 от 20.05.2020 г.), все пациентки дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследуемые группы были сопоставимы между собой по возрасту (32,2 (5,4) года и 31,0 (5,3) года, Т=0,73; р=0,465), паритету родов (число первородящих в основной группе – 12 беременных (50,0%), в контрольной – 7 беременных (36,8%) (р=0,291) и беременностей (2,29 (1,21) и 2,47 (1,71); Т=-0,443; р=0,792). Средний срок гестации в основной группе был ниже – 38,2 (0,92) недели, чем в контрольной группе – 39,3 (0,65) недели (Т=-4,74; р=0,000). Результаты анализа ПЦР-РВ образцов плаценты представлены в таблице 1.

 

Таблица 1 . Распределение микроорганизмов в ткани плаценты в зависимости от целостности плодного пузыря при доношенной беременности, определенное методом ПЦР-РВ

Table 1. The distribution of microorganisms in placental tissue depending on the integrity of the fetal bladder during full-term pregnancy, determined by real-time PCR

Показатели	Основная группа (n=24)		Группа контроля (n=19)		р1	р2
	n, %	Абс., lg (Ме (Q1; Q3))	n, %	Абс., lg (Ме (Q1; Q3))
КВМ	24 (100)	5,2 (4,9; 5,5)	19 (100)	5,5 (4,9; 6,1)	-	0,20
ОБМ лабораторная	16 (66,7)	3,2 (0; 3,4)	15 (78,9)	3,3 (3,1; 3,5)	0,39	0,31
ОБМ расчетная	7 (29,2)	0 (0; 3,0)	5 (26,3)	0 (0; 3,1)	0,36	0,84
Lactobacillus spp.	2 (8,3)	4,4 (3,3; 4,7)	0	н/о	0,21	0,22
Enterobacteriaceae spp.	4 (16,7)	3,2 (0; 3,2)	5 (26,3)	3,2 (3,1; 3,2)	0,52	0,42
Streptococcus spp.	0	н/о	0	н/о	.	.
Staphylococcus spp.	0	н/о	0	н/о	.	.
Gardnerella vaginalis+Prevotella bivia+Porphyromonas spp.	0	н/о	0	н/о	.	.
Eubacterium spp.	1 (4,2)	3,0	0	н/о	0,40	0,40
Sneathia spp.+Leptotrichia spp.+Fusobacterium spp.	0	н/о	0	н/о	.	.
Megasphaera spp.+Veillonella spp.+Dialister spp.	0	н/о	0	н/о	.	.
Lachnobacterium spp.+Clostridium spp.	0	н/о	0	н/о	.	.
Mobiluncus spp.+Corynebacterium spp.	2 (8,3)	3,1(3,0; 3,1)	0	н/о	0,22	0,22
Peptostreptococcus spp.	0	н/о	0	н/о
Atopobium vaginae	1 (4,2)	1,3	0	н/о	1,00	0,40
Candida spp.	0	н/о	0	н/о	.	.
Mycoplasma hominis	0	н/о	0	н/о	.	.
Ureaplasma (urealyticum + parvum)	0	н/о	0	н/о	.	.
Mycoplasma genitalium	0	н/о	0	н/о	.	.
Неизвестные виды	12 (50,0)	2,1 (0; 3,3)	12 (63,2)	3,2 (0; 3,4)	0,36	0,09
Стерильные	8 (33,3)	н/о	4 (21)	н/о	0,13	-
Анаэробы	4 (16,7)	0 (0,0)	0	0 (0;0)	0,06	0,36

Примечание: р1 – точный критерий Фишера; р2 – критерий Манна – Уитни.

 

Все образцы имели хорошее КВМ: основная группа – 10^5,2 ГЭ/образце (10^4,9; 10^5,5) и контрольная – 10^5,5 ГЭ/образце (10^4,9; 10^6,1).

ОБМл в обеих группах была выше, чем ОБМр. Частота выявления ОБМл в основной группе составила 16 беременных (66,7%), а в контрольной группе – 15 случаев (78,9%) (р=0,39), частота положительной ОБМр была ниже в обеих группах: 7 случаев (29,2%) и 5 случаев (26,3%) соответственно (р=0,36). Наибольшую частоту составляли так называемые «неидентифицируемые» виды: 12 случаев (50,0%) в основной группе и 12 (63,2%) в контрольной группе (р=0,36). Под неидентифицируемыми видами мы понимали ситуации, когда ОБМл определялась, то есть наличие ДНК некой микробной массы присутствовало, а все перечисленные в панели микроорганизмы не определялись.

В основной группе ОБМл и ОБМр были сопоставимы с таковыми показателями в контрольной группе. При целом плодном пузыре из идентифицируемых микроорганизмов были выявлены представители Enterobacteriaceae spp. в 5 случаях (26,3%), другие виды микроорганизмов не определялись. В основной группе разнообразие видов микроорганизмов было значимо больше: на первом месте по частоте выявления также наблюдались Enterobacteriaceae spp. – 4 случая (16,7%). Lactobacillus spp. и анаэробы выявлены только в основной группе в 2 случаях (8,3%) и 4 случаях (16,7), однако различия были не значимы (р=0,21 и р=0,06). Из анаэробов в единичных случаях в основной группе были выявлены Eubacterium spp. (4,2%), Atopobium vaginae (4,2%), Mobiluncus spp. + Corynebacterium spp. (8,3%%).

ОБСУЖДЕНИЕ

Появление современных методов исследования, таких как амплификация генов и секвенирование ДНК, позволило совершить прорыв в метагеномике, которая может идентифицировать геном хозяина с обитающими микроорганизмами в определенной эконише. С внедрением новых методов вопрос о существовании микробиоты плаценты и понятие о том, что есть его норма и патология при беременности, становятся краеугольным камнем больших акушерских синдромов. Более современные исследования с применением культуральных и метагеномных методик демонстрируют наличие микроорганизмов в полости матки и плаценте при физиологически протекающей беременности [5, 8, 13, 20]. Однако в ряде других исследований указывается, что существование плацентарной микробиоты весьма сомнительно, так как бактериальная колонизация имеет низкую биомассу и, следовательно, может являться просто результатом загрязнения [21–23].

Большинство микроорганизмов, населяющих человеческий организм, не растут in vitro, и поэтому исследование микробиома стало доступным только при использовании высокотехнологичных методов – секвенировании генома, ПЦР-диагностике. Проект «Микробиом человека» [14] был начат в 2008 году Национальным институтом здоровья (NICE) с целью характеристики колонизации всего бактериального сообщества «Тело человека». Это позволило бы определить, существует ли связь между микробиомными изменениями и появлением специфических заболеваний.

Если в более ранних публикациях речь шла о Lactobacillus и Bifidobacterium (обитателях нормальной кишечной микрофлоры) в биоптатах плаценты [24], то сейчас при физиологически протекающей беременности во многих исследованиях доказано пребывание в тканях плаценты ДНК Enterobacteriaceae spp. [11, 25], что совпадает с полученными нами данными. По результатам работы A.L. Prince [11] в плаценте выявляются Рroteobacteria, Enterobacteriaceae (Enterobacter, Escherichia, Shigella), Lactobacillus и Propionbacteriaceae. В другом исследовании в плаценте идентифицированы Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. [26].

Наличие Lactobacillus и Propionibacterium в плаценте, а также в кишечнике плода позволяет новорожденному проявлять толерантность к бактериям через феномен прайминга, способствует врожденной экспрессии генов иммунитета у плода и созданию здорового микробиома у новорожденного [11, 27]. Присутствие микробной колонизации плаценты у большинства женщин без явных неблагоприятных перинатальных исходов подтверждает, что плацентарный микробиом может быть полезным [28, 29]. В рамках нашего исследования у пациенток с интактным плодным пузырем у 78,9% была выявлена общая бактериальная масса, а идентифицированы микробы с помощью панели «Фемофлор» были только у 26% – Enterobacteriaceae spр., однако при условии наличия столь высокого процента микробного обсеменения, септических либо других осложнений у обследованных пациенток в послеродовом периоде не наблюдалось, соответственно выявление плацентарного микробиома не является предиктором септических осложнений.

Секвенирование всего генома продемонстрировало, что плацента содержит уникальный микробиом, несколько похожий на оральный, а не вагинальный [2, 8]. Однако не совсем понятно, характерно ли это сходство для физиологически протекающей беременности, или связь реализуется при инфекциях пародонта и впоследствии приводит к повышению частоты осложнений [4, 11, 27]. Так, предполагаемая связь между дисбиозом полости рта и осложнениями беременности ставит в центр дискуссии вопрос о микробиоте плаценты: клинические исследования связи между гингивитом и преждевременными родами выявили наличие бактерий в очень старых структурах плаценты – виллезном дереве и базальной пластинке [30].

Культурно-зависимые исследования идентифицировали представителей родов Prevotella, Bacteroides, Peptostreptococcus, Gardnerella, Mobiluncus и Mycoplasma genitalium в плацентах женщин, родивших недоношенных с преэклампсией или без нее, что предполагает участие нескольких штаммов бактерий в патогенезе акушерских осложнений [33], как видно, все они являются участниками формирования бактериального вагиноза. Исследования плацентарной микробиоты при преждевременных родах на основе ДНК показали повышенное обогащение видов Burkholderia и увеличенное относительное содержание Protobacteria и Actinomyces spp., а также других смешанных некультивируемых анаэробов [33]. Однако в случае хорио-амнионита было зарегистрировано более высокое содержание Streptococcus agalactiae, Fusobacterium nucleatum и Ureaplasma parvum [33]. Учитывая критерии исключения в группах обследуемых и доношенную беременность, вышеперечисленные виды микроорганизмов выявлены не были. Более того, выявление Enterobacteriaceae spp., Lactobacillus spp. и остальных представителей анаэробной микробиоты не являлось предиктором неблагоприятных материнских и перинатальных исходов. Во всех случаях гнойно-септических осложнений у новорожденных и матерей не наблюдалось.

Таким образом, плацента содержит некую ДНК микроорганизмов. Нельзя утверждать, что это микробиота в общепринятом понимании, которая может быть культивирована при микробиологическом исследовании, что подтвердили результаты микробиологического исследования в нашей работе. Тем не менее плацента исходно развивается не в стерильной среде (эндометрий в норме содержит собственную микробиоту), и, соответственно, ее обсеменение может происходить как контактно, так и гематогенно. Ряд исследований демонстрирует наличие микробного генетического материала как на плаценте, так и в эндометрии здоровых женщин вне беременности [1, 5, 13, 26, 31].

Несовпадение лабораторной ОБМ и суммарного количества идентифицированных микроорганизмов – расчетной ОБМ, говорит о том, что в исследуемом биоматериале присутствуют микроорганизмы, выявление которых не предусмотрено используемым набором реагентов. Максимальная частота «неизвестных» видов выявлена у пациенток с интактными оболочками. Наше исследование подтвердило данные других авторов [11, 25] о том, что при физиологически протекающей беременности наиболее часто идентифицируются Propionibacterium spp., Protobacteria, Bacteroides, Fusobacteria [31], Firmicutes [25].

ВЫВОДЫ

Таким образом, ОБМ плаценты была выявлена у 66,7% пациенток при ПРПО и у 78,9% при интактном плодном пузыре. Основными представителями в плаценте были микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae spp.: Ме 103,2 ГЭ/образце при ПРПО и Ме 103,2 ГЭ/образце – при интактном плодном пузыре (р>0,05). Не идентифицированные тестом «Фемофлор-16» микроорганизмы установлены у 50% пациенток с ПРПО с Ме 10^2,1 ГЭ/образце и у 63,2% пациенток с интактным плодным пузырем с Ме 10^3,2 ГЭ/образце. Взаимосвязи между ПРПО и особенностями микробиоты плаценты не установлено, однако присутствие Lactobacillus spp., анаэробов в тканях плаценты характерно только для пациенток с ПРПО.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Mariya A. Kaganova

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: m.a.kaganova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-5879-418X

PhD, Associate Professor, Department of Obstetrics and Gynecology of the Institute of Postgraduate Education

Russian Federation, Samara

Natalya V. Spiridonova

Samara State Medical University

Email: n.v.spiridonova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-3928-3784

PhD, Professor, Head of the Department of Obstetrics and Gynecology of the Institute of Postgraduate Education

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files