Разработка и валидация методики количественного определения биологически активного соединения n-(2-[4-оксо-3(4н)-хиназолинил]пропионил)гуанидина

Полный текст

Введение

При создании новых лекарственных препаратов особое внимание уделяют вопросам стандартизации, которая подразумевает разработку нормативной документации, регламентирующей показатели качества и методики их определения на всех этапах жизненного цикла препарата. Объектом нашего исследования стало впервые синтезированное в ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России биологически активное соединение (БАС) — N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)-гуанидин (VMA-13-15) (см. рисунок), проявляющее кардиопротекторную и нейропротекторную активность, перспективное для создания эффективных лекарственных препаратов [3].

Одним из этапов создания нормативной документации на новое лекарственное средство является разработка методик количественного определения действующего вещества в фармацевтической субстанции. Доступным и надежным методом анализа качества лекарственных средств признана УФ-спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях спектра [4].

Цель исследования — выбор и обоснование условий определения содержания биологически активного соединения VMA-13-15 спектрофотометрическим методом.

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 3 сериях лабораторных образцов БАС VMA-10-15. В работе использовали мерную посуду класса А, аналитические весы Госметр ВЛ-124. Измерение электронных спектров в УФ-области проводили на спектрофотометре СФ-2000. В качестве стандартного образца (СО) использовали дважды перекристаллизованный и высушенный до постоянной массы порошок N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)гуанидина.

Для измерения УФ-спектров нами были приготовлены растворы по следующей методике: около 0,05 г (точная навеска) СО БАС помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 30 мл соответствующего растворителя, взбалтывают до полного растворения и доводят этим же растворителем до метки (раствор А). При измерении спектра в области 250–280 нм 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки соответствующим растворителем. При измерении оптической плотности в области 220–240 нм 10 мл раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят соответствующим растворителем до метки (раствор Б), затем 2 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и далее поступают, как описано выше. В качестве раствора сравнения используют соответствующий растворитель.

 

Структурная формула VMA-13-15

Structural formula VMA-13-15

 

Методика количественного определения БАС: около 0,05 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и далее готовят растворы А и Б, как указано выше, используя в качестве растворителя воду очищенную. 2 мл раствора А или 3 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой очищенной до метки. Оптическую плотность полученных растворов измеряют при длинах волн 266 и 226 нм соответственно. Параллельно измеряют оптическую плотность растворов стандартного образца БАС.

Приготовление раствора стандартного: около 0,05 г (точная навеска) СО БАС помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 30 мл воды очищенной, взбалтывают до полного растворения и доводят этим же растворителем до метки (раствор В). Далее готовят разведения согласно методике количественного определения субстанции, описанной выше.

Расчет содержания БАС в анализируемых образцах проводили с учетом оптической плотности стандартного образца

$x\%=\frac{A_x·C·50·100·100}{A_{CT}·V·a(100-W)}$

Для построения градуировочных графиков готовили серию растворов, используя исходные растворы А или Б. С этой целью 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 мл этих растворов переносили в мерные колбы вместимостью 100 мл и доводили до метки соответствующим растворителем.

Валидационную характеристику «линейность» проверяли экспериментально измерением аналитического сигнала для проб с различным содержанием исследуемой субстанции в пределах аналитической области методики — от 70 до 130 % номинального содержания [2].

Проверку прецизионности (на уровне сходимости) проводили по 6 параллельным определениям и рассчитывали величины стандартного отклонения (RS) и относительного стандартного отклонения (RSD) (см. табл. 2).

 

Таблица 1 / Table 1

Спектрофотометрические характеристики N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)гуанидина (VMA-13-15)

Spectrophotometric characteristics of N-(2-[4-oxo-3(4H)-quinazolinyl]propionyl)guanidine (VMA-13-15)

Растворитель	Длина волны, нм	Уравнение регрессии	R	Аналитическая область, С%		ε
Вода	226	у = 1028х + 0,007	0,9992	0,0002–0,0008	1050	1,61
	266	у = 228,1х – 0,022	0,9979	0,001–0,004	218	1,34
	302	у = 124,7х – 0,038	0,9993	0,003–0,006	116	1,21
0,1 М раствор натрия гидроксида	226	у = 1135х – 0,058	0,9988	0,0003–0,0009	1025	2,20
	266	у = 225,5х – 0,010	0,9973	0,001–0,004	221	1,46
	302	у = 137,7х – 0,075	0,9994	0,003–0,006	120	2,13
0,1 М раствор кислоты хлористоводородной	227	у = 903,9х – 0,046	0,9954	0,0003–0,0009	819	2,25
	273	у = 214,5х – 0,020	0,9986	0,001–0,004	205	1,34

 

Таблица 2 / Table 2

Результаты количественного определения N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)гуанидина (VMA-13-15)

Results of quantitative determination of N-(2-[4-oxo-3(4H)-quinazolinyl]propionyl)guanidine (VMA-13-15)

№	1-я серия			2-я серия			3-я серия
	Навеска	Ах	Найдено	Навеска	Ах	Найдено	Навеска	Ах	Найдено
1	0,0550	0,426	99,88	0,0560	0,425	99,64	0,0499	0,422	98, 94
2	0,0501	0,423	99,17	0,0481	0,421	98,70	0,0520	0,431	101,05
3	0,0490	0,429	100,58	0,0552	0,427	100,11	0,0502	0,428	100,35
4	0,0511	0,431	101.52	0,0571	0,432	101,28	0,0565	0,423	99,17
5	0,0523	0,422	98,94	0,0510	0,422	98,94	0,0513	0,437	102,4
6	0,0552	0,436	102,52	0,0501	0,435	101,99	0,0563	0,426	99,88
Метрологические характеристики 1-я серия: хср = 100,43 %, SD = 1,30, RSD = ±1,30 % 2-я серия: хср = 100,11 %, SD = 1,29, RSD = ±1,29 % 3-я серия: хср = 100,29 %, SD = 1,28, RSD = ±1,28 %

 

№	Внутрилабораторная прецизионность
	Исследователь 1			Исследователь 2
	Навеска	Ах	Найдено	Навеска	Ах	Найдено
1	0,0550	0,426	99,88	0,0515	0,431	101,35
2	0,0501	0,423	99,17	0,0489	0,429	100,58
3	0,0490	0,429	100,58	0,0553	0,423	99,17
4	0,0511	0,431	101.52	0,0507	0,427	100,11
5	0,0523	0,422	98,94	0,0499	0,425	99,64
6	0,0552	0,436	102,52	0,0541	0,438	102,56
Метрологические характеристики Исследователь 1: хср = 100,43 %, SD = 1,3, RSD = ±1,3 % Исследователь 2: хср = 100,56 %, SD = 1,18, RSD = ±1,18 %

 

№	Межлабораторная прецизионность
	Спектрофотометр 1			Спектрофотометр 2			Спектрофотометр 3
	Навеска	Ах	Найдено	Навеска	Ах	Найдено	Навеска	Ах	Найдено
1	0,0560	0,425	99,64	0,0550	0,427	100,1	0,0567	0,426	99,88
2	0,0481	0,421	98,70	0,0501	0,431	101,05	0,0511	0,423	99,17
3	0,0552	0,427	100,11	0,0490	0,426	99,88	0,0545	0,425	99,64
4	0,0571	0,432	101,28	0,0511	0,432	101,28	0,0499	0,424	99,41
5	0,0510	0,422	98,94	0,0523	0,439	102,78	0,0503	0,422	98,94
6	0,0501	0,435	101,99	0,0554	0,428	100,35	0,0506	0,435	101,99
Метрологические характеристики Спекрофотометр 1: хср = 100,11 %, SD = 1,29, RSD = ±1,29 % Спекрофотометр 2: хср = 100,90 %, SD = 1,06, RSD = ±1,06 % Спекрофотометр 3: хср = 99,83 %, SD = 1,10, RSD = ±1,10 %

 

При исследовании внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности анализ проводили два сотрудника в разные дни. Межлабораторную прецизионность подтверждали путем проведения измерений на трех разных приборах на одной серии БАС.

Результаты исследования и их обсуждение

Электронные спектры поглощения водных растворов органических веществ, имеющие заместители как кислотного, так и основного характера, могут иметь различный характер в зависимости от значений рН используемого раствора. На смещение спектров поглощения, а также интенсивность поглощения, большое влияние может оказывать содержание ионной или молекулярной формы исследуемого вещества. Известно, что влияние рН раствора практически исключается в том случае, если значение рН = рК ± 3, поскольку в данных условиях исследуемое вещество находится на 99,9 % в одной из своих форм.

Константы ионизации определяли с помощью электронного ресурса chemicalize.com, при этом оказалось, что вещество имеет константу как кислота (рК₁ = 11,3) и две константы как основание (рК₃ = 4,71 и рК₂ = 8,77).

Полученные значения рК позволили рассчитать количества молекулярной и ионизированной формы субстанции (%) в зависимости от рН среды водного раствора.

Значения рК = 4,71 и рК = 8,77 свидетельствуют, что молекула БАС в растворе может проявлять основные свойства и быть полностью ионизированной как основание только при рН ≤ 1,7. Так как водные растворы субстанции, приготовленные для измерения оптической плотности, имеют значения pH в области 5,5–5,7, можно считать, что в растворе содержится смесь молекулярной и ионизированной форм БАС как основания, так и молекулярной формы как кислоты (рК = 11,77) [1].

В полностью ионизированной форме как кислоты БАС находится в растворах при рН более 14. При рН более 12 (0,1 М раствор гидроксида натрия) можно считать, что ионизированная форма в растворе содержится на 99 % (рН = рК ± 2).

Таким образом, для анализа нами были использованы вода очищенная, а также щелочные и кислые растворы.

Как следует из табл. 1, спектры поглощения БАС как в воде, так и в растворе 0,1 М гидроксида натрия имеют три максимума поглощения при 226,266 и 302 нм. Однако при использовании щелочного раствора значительно увеличивается интенсивность поглощения по сравнению с поглощением водных растворов. В кислом растворе спектр поглощения имел только два максимума.

Полоса поглощения в области 225–230 нм обусловлена π → π* переходом в насыщенных связях хиназолинового кольца. Характер поглощения в длинноволновой части спектра, вероятно, обусловлен электронными переходами, включающими всю сопряженную систему хиназолинового кольца и пропионилгуанидиновой группы как акцептора электронов.

В соответствии с требованиями Общей фармакопейной статьи ГФ ХIII «Спектрофотомерия в ультрафиолетовой и видимой областях», выбор концентрации измеряемого раствора при разработке методики количественного определения проводится с учетом минимальной систематической ошибки, которая получается при значении оптической плотности 0,4343. Поэтому подбор концентраций для построения градуировочного графика и расчет навески проводили исходя из данного значения [2].

При изучении влияния растворителя на точность результатов спектрофотометрического анализа измеряли оптическую плотность растворов, приготовленных для построения градуировочных графиков в максимумах поглощения как в коротковолновой (225–230 нм), так и в длинноволновой области (265–270 нм). Были установлены границы концентраций, в которых соблюдается основной закон светопоглощения, рассчитаны уравнения регрессии градуировочных графиков, коэффициенты корреляции и значения удельных показателей поглощения в максимумах поглощения в различных растворителях (табл. 1).

Как следует из табл. 1, аналитическая область во всех растворителях при длине волны 226–227 нм находится в границах от 0,0002–0,0009 % вещества в пробе, при длине волны 266 и 273 нм — от 0,001–0,004 % и для 302 нм — 0,002–0,008 %. При этом уравнения градуировочных графиков имеют незначительную величину свободного члена, то есть прямые градуировочных графиков проходят через начало координат. Коэффициент корреляции (r) находится в пределах 0,9942–0,9999, следовательно, не превышает значения r ≤ 0,999, установленные ГФ, то есть результаты оценки линейности свидетельствуют о пригодности выбранной методики количественного определения БАС в исследованном диапазоне концентраций.

Специфичность методики подтверждали соответствием положениям максимумов исследуемого БАС и СО.

Выбор оптимальной длины волны производили на основании ошибки расчета удельного показателя для каждой длины волны и соответствующего растворителя. При использовании воды очищенной ошибка не превышает 1,6 % при всех аналитических длинах волн. В растворе щелочи минимальная ошибка наблюдалась при 266 нм — 1,46 %, а при 226 и 302 нм — 2,2 %. Для раствора кислоты минимальная ошибка наблюдалась в коротковолновой области — 1,34 %.

В табл. 2 приведены данные, позволяющие предложить для разрабатываемой методики получения растворов использовать воду и измерять оптическую плотность при 266 нм.

Важным этапом оценки аналитической методики служит подтверждение ее валидности, по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, прецизионность и правильность.

В приемлемых условиях по методике, приведенной выше, были проанализированы три образца БАС. Как следует из табл. 2, содержание БАС в исследуемых образцах находится в пределах 98–102 % и относительная погрешность измерения составляет 1,29 %, то есть методика прецизионна по сходимости результатов и приемлема для анализа исследуемого соединения [5].

При сравнении результатов, полученных двумя сотрудниками (внутрилабораторная прецизионность), следует, что различия между их результатами незначительны (табл. 2). При проведении межлабораторной прецизионности значения RSD составили 1,29, 1,06 и 1,10 % соответственно. Это показывает, что различия между результатами также незначительны. Полученные результаты определения прецизионности по трем вариантам свидетельствуют о валидности методики по показателю прецизионности.

Правильность методики подтверждали анализом на трех уровнях анализируемых концентраций соответствующих 80, 100, 120 % номинального содержания. На каждом уровне проводили по три определения. Как известно, приемлемыми критериями правильности спектрофотометрической методики определения субстанции являются результаты открываемости на уровне 98–102 % и отсутствие значимой систематической ошибки. Полученные результаты свидетельствуют, что значения открываемости R, равные 100,11, находятся в пределах 98–102 % при значении RDS равном 1,3 %, что является признаком валидности по данному показателю [5].

Заключение

С использованием полученных расчетным путем значений констант ионизации обоснован выбор растворителя и разработана спектрофотометрическая методика количественного определения БАС N-(2-[4-оксо-3(4H)-хиназолинил]пропионил)гуанидина.Показано, что предложенная методика специфична, линейна в области аналитических концентраций, а также прецизионна и правильна, что подтверждает возможность ее использования для количественного определения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Евгения Владимировна Компанцева

Пятигорский медико-фармацевтический институт — филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: pharmachemistry@mail.ru

доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии

Россия, Пятигорск

Дарья Николаевна Луценко

Пятигорский медико-фармацевтический институт — филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: Lucenkodasha95@mail.ru

аспирант кафедры фармацевтической и токсикологической химии

Россия, Пятигорск

Александр Алексеевич Глушко

Пятигорский медико-фармацевтический институт — филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: pharmachemistry@mail.ru

кандидат фармацевтических наук, старший преподаватель кафедры неорганической, физической и коллоидной химии

Россия, Пятигорск

Список литературы

Дополнительные файлы