Разработка подходов к стандартизации коры ореха черного

Полный текст

Введение

Орех черный (Juglans nigra L.) — растительный объект, являющийся представителем рода Орех (Juglans L.) семейства Juglandaceae. Известно, что род Орех включает более 20 видов древесных растений, произрастающих в теплоумеренных районах Евразии и Северной Америки [2, 6].

Интерес к ореху связан с наличием в надземной части ореха черного различных нафтохинонов, оказывающих антибактериальную активность, в частности: юглон, гидроюглон, глюкозид гидроюглона. Наряду с вышеуказанными, растение содержит и следующие ценные биологически активные соединения (БАС): липидные вещества, азотистые вещества, углеводы, органические кислоты, флаваноиды и другие фенольные соединения, которые также вносят свой вклад в фармакологическое действие [1, 3, 8].

На наш взгляд, вклад в основной антимикробный эффект, наряду с нафтохинонами, вносят и флавоноиды. Необходимо учитывать тот факт, что в сырье, переназначенном для получения водных, спиртовых, спирто-водных извлечений, а также экстрактов, существует необходимость определения действующих веществ гидрофильной природы, к которым относят флавоноиды данного растения [7].

Ранее нами было проведено сравнительное фитохимическое исследование видов лекарственного растительного сырья (ЛРС) рода Орех. Во всех электронных спектрах исследуемых образцов обнаруживается максимум поглощения при длине волны 270 нм, что свидетельствует о вкладе флавоноидов в кривую поглощения ультрафиолетовых (УФ) спектров. В результате сравнительного исследования электронных спектров водно-спиртовых извлечений из различных видов сырья представителей рода Орех был сделан вывод о целесообразности использования в качестве целевого ЛРС кору ореха черного (Juglans nigra L.).

Обзор литературы показал возможность стандартизации листьев ореха черного при проведении количественного определения суммы нафтохинонов методом фотоколориметрии в пересчете на юглон [4, 5]. Извлечение получали методом двухкратной экстракции 20 % этиловым спиртом с последующим упариванием и трехкратной экстракцией диэтиловым эфиром [4, 5]. При этом определено, что содержание нафтохинонов в листьях ореха черного достигает 0,24 ± 0,01 % в пересчете на юглон [4, 5]. Принимая во внимание достаточную трудоемкость в ходе проведения пробоподготовки, сложность проведения анализа для нафтохинонов в качестве целевой группы БАС, а также отсутствие литературных данных относительно стандартизации коры ореха черного (Juglans nigra L.), актуальным является продолжение исследований в этом направлении.

Материалы и методы

Материалом исследования служила кора ореха черного, заготовленная в период сокодвижения (апрель) в 2018 и 2019 гг. в ботаническом саду Самарского государственного университета. Кора была разрезана на полоски длиной до 15 см и шириной 2–3 см. Сушка коры проводилась естественным способом под навесом без доступа прямых солнечных лучей. Окончание сушки проверяли по ломкости коры.

Результаты исследования и обсуждение

С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного были изучены УФ-спектры растворов водно-спиртовых извлечений из данного сырья (рис. 1 и 2). Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения ореха черного наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (рис. 1), как и в случае рутина (рис. 3). Изучение УФ-спектров государственного стандартного образца (ГСО) рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм (рис. 3). В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из коры ореха черного в дифференциальном варианте обнаруживается максимум поглощения при длине волны 416 нм (рис. 4), который практически соответствует максимуму спиртового раствора рутина.

 

Рис. 1. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из коры ореха черного: 1 — раствор извлечения; 2 — раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида

Fig. 1. Electronic spectra of solutions of water-ethanolic extraction from Juglans nigra bark: 1 — solution of extraction; 2 — solution of extraction with the addition of aluminum chloride

 

Рис. 2. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из коры ореха черного: 1 — раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида; 2 — раствор рутина с добавлением алюминия хлорида

Fig. 2. Electronic spectra of solutions of water-ethanolic extraction from Juglans nigra bark: 1 — solution of extraction with the addition of aluminum chloride; 2 — solution of rutin with the addition of aluminum chloride

 

Рис. 3. Электронные спектры спиртовых растворов рутина: 1 — исходный раствор; 2 — раствор с добавлением алюминия хлорида

Fig. 3. Electronic spectra of ethanolic solutions of rutin: 1 — initial solution; 2 — solution with the addition of aluminum chloride

 

Рис. 4. Электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из коры ореха черного (дифференциальный вариант)

Fig. 4. Electronic spectra of solutions of water-ethanolic extraction from Juglans nigra bark (differential type)

 

С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов нами определены оптимальные условия экстракции флавоноидов в коре ореха черного: экстрагент 80 % этиловый спирт; соотношение «сырье – экстрагент» — 1 : 30; время экстракции — извлечение на кипящей водяной бане в течение 60 мин; степень измельчения сырья — 2 мм (табл. 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из коры ореха черного

Dependence of the recovery rate of total flavonoids from the Juglans nigra bark

№	Экстрагент	Соотношение сырье : экстрагент	Время экстракции, мин	Степень измельчения ЛРС, мм	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, %
I эксперимент
1	40 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	4,48 ± 0,02
2	50 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	4,59 ± 0,01
3	60 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	4,69 ± 0,02
4	70 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	4,78 ± 0,02
5	80 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	4,94 ± 0,03
6	90 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	4,71 ± 0,01
7	96 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	3,92 ± 0,01
II эксперимент
8	80 % этиловый спирт	1 : 30	30	2	4,79 ± 0,03
9	80 % этиловый спирт	1 : 30	45	2	4,88 ± 0,03
10	80 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	5,10 ± 0,02
11	80 % этиловый спирт	1 : 30	90	2	5,03 ± 0,02
12	80 % этиловый спирт	1 : 30	120	2	4,76 ± 0,03
III эксперимент
13	80 % этиловый спирт	1 : 20	60	2	4,7 ± 0,01
14	80 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	5,10 ± 0,03
15	80 % этиловый спирт	1 : 50	60	2	5,08 ± 0,02
IV эксперимент
16	80 % этиловый спирт	1 : 30	60	1	4,80 ± 0,02
17	80 % этиловый спирт	1 : 30	60	2	5,13 ± 0,02
18	80 % этиловый спирт	1 : 30	60	3	4,55 ± 0,01

 

Методика количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 80 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 416 нм через 40 мин после приготовления. В качестве раствора сравнения берут раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1 : 30) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора 96 % этиловым спиртом до метки.

Примечание: Приготовление раствора рутина-стандартного образца. Около 0,02 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл 70 % этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70 % этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 2 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (испытуемый раствор Б рутина). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 416 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 2 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (раствор сравнения Б рутина).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (x) вычисляют по формуле:

$x=\frac{D·m_{\circ }·30·50·2·100·100}{D_{\circ }·m·50·25·(100-W)}$

где D — оптическая плотность испытуемого раствора; D_o — оптическая плотность раствора ГСО рутина; m — масса сырья, г; m_o — масса ГСО рутина, г; W — потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 416 нм — 238.

$x=\frac{D·30·50·100}{m·238·(100-W)}$

где D — оптическая плотность испытуемого раствора; m — масса сырья, г; m_o — масса ГСО рутина, г; 238 — удельный показатель поглощения () ГСО рутина при 416 нм; W — потеря в массе при высушивании, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в коре ореха черного представлены в табл. 2. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного с доверительной вероятностью 95 % составляет ±1,20 % (табл. 2).

 

Таблица 2 / Table 2

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного

Metrological characteristics of the method of quantitative determination of total flavonoids in the Juglans nigra bark

n	f	X, %	S2	S	SX	P, %	T (P, t)	∆X	∆X	E, %
11	10	5,13	0,00044	0,02102	0,006338	95%	2,23	0,05	0,02	1,20

 

Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов коры ореха черного и рутина с алюминием хлоридом. Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,00520 до 0,02080 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,99996.

Правильность методики определяли методом добавок путем добавления раствора рутина с известной концентрацией (25, 50 и 75 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 98 %.

С использованием разработанной методики нами проанализирован ряд образцов травы монарды дудчатой (табл. 3) и при этом определено, что содержание суммы флавоноидов варьирует от 3,92 до 4,28 %. На основе полученных данных нами рекомендован нижний предел содержания суммы флаваноидов для сырья данного растения не менее 4,0 %.

 

Таблица 3 / Table 3

Содержание суммы флавоноидов в образцах коры ореха черного

Сontent of the flavonoids in the Juglans nigra bark

№ образца	Характеристика образца сырья	Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (%) в пересчете на рутин
1	Ботанический сад Самарского университета (март 2018 г.)	5,13 ± 0,02
2	Ботанический сад Самарского университета (март 2019 г.)	4,68 ± 0,04

 

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности стандартизации коры ореха черного путем определения суммы флавоноидов методом спектрофотометрии при аналитической длине волы 416 нм в пересчете на рутин.

Выводы

1. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в коре ореха черного методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина при аналитической длине волны 416 нм.
2. Содержание суммы флавоноидов для коры ореха черного травы варьирует от 4,68 до 5,13 %. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет 1,20 %.
3. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для коры ореха черного нижний предел содержания суммы флавоноидов не менее 4,0 %.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Наталья Игоревна Зименкина

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: nata.zimenkina@mail.ru

аспирант кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Россия, Самара

Владимир Александрович Куркин

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: kurkinvladimir@yandex.ru

доктор фармацевтических наук, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, почетный профессор

Россия, Самара

Список литературы

Дополнительные файлы