Исследование петиолярных признаков листьев алтея лекарственного.

Полный текст

Введение. Алтей лекарственный (Althaea officinalis L.) представляет собой травянистый многолетник семейства Мальвовые (Malvaceae) высотой от 60 до 150 см, обладающий мощной корневой системой [1].

Алтей лекарственный имеет неравномерный евроазиатский ареал распространения. Он охватывает большую часть Европы, за исключением северных регионов Скандинавских стран и Шотландии. Произрастает также в Северной Африке, Иране, Афганистане, Малой Азии и северо-западных областях Китая и Монголии. На территории России вид широко представлен по всей европейской части, включая предгорья Кавказа и проникает в южные районы Западной Сибири. География произрастания охватывает казахстанские степи, алтайские низменности, оазисные участки пустынных территорий и умеренные зоны Центральной Азии, где растение селится вне аридных ландшафтов [2, 3]. Алтей лекарственный произрастает преимущественно на влажных лугах, вдоль берегов рек, на заболоченных лугах, в балках, между редкими кустарниками и на солончаковых местах. Обычно образует небольшие группы, иногда изреженные заросли [4].

Алтей лекарственный – ценное лекарственное растение, применяемое в медицине благодаря высокому содержанию слизистых веществ [5]. Наибольшее внимание в научной литературе уделяется корням алтея, тогда как надземная часть (трава) изучена в недостаточной степени. Трава алтея лекарственного содержит до 12% полисахаридов и не менее 2% восстанавливающих сахаров. Помимо этого, в траве содержатся пектиновые вещества, аскорбиновая кислота, флавоноиды, аспарагин, бетаин, каротин, лецитин, фитостерин, минеральные соли и незначительное количество эфирного масла [5, 6].  На основе экстрактов травы алтея лекарственного с добавлением гидрокарбоната натрия получают препарат Мукалтин, широко применяющийся при острых и хронических заболеваниях дыхательных путей, которые сопровождаются кашлем и образованием трудноотделяемой мокроты повышенной вязкости [6, 7]. Водные вытяжки из травы алтея обладают обволакивающими, защитными, мягчительными, противовоспалительными свойствами, а также оказывают обезболивающее действие [8, 9].  Их рекомендуют принимать при гастритах и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, особенно при повышенной кислотности желудочного сока [10].

Помимо фармакологической ценности, алтей лекарственный привлекает внимание своими морфологическими особенностями, играющими ключевую роль в идентификации вида. Его листья простые, очерёдные, черешковые, длина которых обычно не превышает 2–6,25 см. Нижние и средние листья имеют яйцевидную форму с тремя-пятью лопастями, тогда как верхние — продолговато-яйцевидные. Для листьев характерна заостренная верхушка, сердцевидное основание и неровный городчато-зубчатый край. Жилкование пальчатое. Поверхность листовой пластины с обеих сторон покрыта опушением, более густым на нижней стороне, что придает ей серовато-зеленый оттенок [1].

 «Трава алтея лекарственного» (Althaeae officinalis herba) — морфологически сложно устроенное сырьё, содержащее как стеблевую часть растения, так и его листья и цветки (рис. 1 А, B, C). Все указанные надземные части алтея являются неотъемлемыми элементами лекарственного растительного сырья «Трава», однако в проекте фармакопейной статьи «Трава алтея лекарственного» в Государственной Фармакопее Российской Федерации XV издания внимание уделяется, в основном, поверхности листовой пластины [11]. На наш взгляд, это не позволяет в полной мере идентифицировать растение, особенно в измельченном виде, что существенно затрудняет стандартизацию сырья и повышает вероятность примеси в сырье или даже его фальсификацию. Например, хатьма тюрингенская (Lavatera thuringiaca), являющаяся примесным видом, имеет сходные микроскопические признаки с алтеем лекарственным, однако биохимические профили растений существенно различаются [12, 13]. В связи с чем особую значимость приобретает анатомо-гистологический анализ. Одним из методов, широко применяемых для подтверждения подлинности лекарственного растительного сырья в фармации, является метод петиолярной анатомии, изучающий особенности строения черешков листьев [14]. Данный метод позволяет отличить целевой вид лекарственного растительного сырья от примесного и является одним из ведущих и высокоспецифичных методов диагностики близкородственных видов растений. Так, петиолярные признаки алтея лекарственного изучались ранее для установления систематических связей внутри семейства Мальвовых и разграничения родов [15]. Однако в фармацевтической практике в настоящее время данные признаки не используются. В связи с этим подробное изучение петиолярных особенностей представляет практический интерес для фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья, где его диагностика как в цельном, так и в измельченном виде является одной из проблем стандартизации [16, 17].

Целью настоящего исследования явилось проведение микроскопического анализа и изучение морфологических и анатомических особенностей листьев алтея лекарственного для выявления селективных диагностических признаков данного вида растения.

Настоящим исследованием были поставлены задачи:

1) анализ и обобщение литературных данных о морфологии и анатомии черешков листьев алтея обыкновенного;

2) выявление возможности дополнительной диагностики признаков видовой специфичности алтея обыкновенного на основе особенностей его строения.

Материалы и методы. Объектами исследования служили:

• образцы листьев алтея лекарственного, заготовленные на экспериментальном участке Ботанического сада Самарского университета (г. Самара) в июле 2024 года;
• образцы листьев алтея лекарственного, заготовленные в районе Зелёной Рощи (черта г. Самара) в июле 2024 года.

          Видовую специфичность листьев алтея лекарственного подтверждали при помощи определителей растений Средней полосы России, а также по гербарным образцам гербарного фонда кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России.

Срезы для исследования готовили на роторном микротоме марки REF 901140, SN S19112191. Анатомо-гистологическое исследование растительного сырья алтея лекарственного проводили с помощью поляризационного микроскопа (ПЛМ-213), световых микроскопов с цифровой насадкой в проходящем и отражённом свете с возможностью измерения объектов (Motic DM-1802, Motic DM-39) на белом поле при увеличении кратностью х40, х100, х400.

Пробоподготовка сырья и микропрепаратов осуществлялась согласно ОФС.1.5.3.0003 Государственной Фармакопеи Российской Федерации XV издания [11]. Высушенные листья с черешками фиксировали в смеси спирта этилового 96%, глицерина ректифицированного и воды очищенной в соотношении 1:1:1. Материал настаивали в течение суток, после чего проводили морфологический анализ и морфолого-анатомическое исследование. Для обеспечения гистохимических реакций использовали реактивы: 10%-й раствор анилина сернокислого (на лигнифицированные оболочки), Судана III (на опробковевшие ткани), регламентированные соответствующими ГОСТами. Морфологические и анатомо-гистологические особенности черешка алтея лекарственного исследовались согласно требованиям ОФС «Листья» Государственной Фармакопеи Российской Федерации [11].

Результаты и обсуждение. По итогам проведенного исследования растительного сырья алтея лекарственного были подтверждены внешние морфологические признаки цельных листьев алтея лекарственного, к характерным особенностям которых можно отнести — форму, размер листьев, наличие выраженного опушения с обеих сторон.

Черешок листа алтея лекарственного тонкий, в длину достигает 40 мм (рис. 1D). На продольном разрезе черешок выглядит цилиндрическим, с гладкой поверхностью. Первичным диагностическим признаком в петиолярной анатомии считаются особенности очертаний поперечных сечений. Для полноты данных эксперимента анализу подвергались поперечные сечения различных частей черешка в базальной (место прикрепления), медиальной (по общей длине) и апикальной области (выходящая в лист) черешка. По результатам анализа выявлена значительная вариабельность строения очертаний поперечных сечений в зависимости от места среза черешка (рис. 1E).

Рис. 1.  Морфологические особенности сырья «Алтея лекарственного трава»: А – фрагменты листовых пластинок сырья; B – фрагмент стебля из сырья; C – фрагмент цветоносов и цветков из сырья; D – фрагмент черешка листа; E – топография поперечных сечений черешка (x10). Обозначения: 1 – базальная область; 2 и 3 – медиальная область; 4 – апикальная область. Fig. 1.   Morphological features of the raw material " Althaeae officinalis herba ": A – fragments of leaf blades of raw materials; B – a fragment of a stem from raw materials; C – a fragment of peduncles and flowers from raw materials; D – a fragment of a petiole of a leaf; E – topography of cross sections of a petiole (x10). Designations:  1 – basal region; 2 and 3 – medial region; 4 – apical region.

 

Так, в базальной части черешок имеет выраженное треугольное очертание поперечного среза с округлыми углами между гранями (рис. 2A). При детальном рассмотрении с абаксиальной стороны (нижней части листа) заметно, что округлый изгиб имеет больший диаметр, чем по боковым рёбрам. Адаксиальная сторона (верхняя часть листа), напротив, характеризуется почти ровной поверхностью. В некоторых экземплярах наблюдается незначительный округлый выступ в центральной части, который может быть связан с особенностями расположения проводящих пучков или адаптацией к условиям среды.

Медиальная часть черешка по всей его длине по анатомо-гистологическим особенностям аналогична базальной, однако имеет меньшие размеры и характер геометрического очертания. Все срезы, сделанные в средней части черешка, имеют форму полукруга с усеченной ровной адаксиальной стороной (рис. 2B). При этом плоскость усечения окружности значительно смещена от центра (рис. 2 B-4), что и оптимизирует гибкость структуры черешка без потери прочности.

Апикальный срез черешка имеет угловатые очертания и вписывается в шестиугольник с усеченной вершиной (рис. 2 С). Очертания поверхности апикальной части имеют выраженный волнистый характер, отличающий её тем самым от базальной и медиальной частей.

Анатомо-морфологический анализ размеров поперечных сечений показывает четкую тенденцию уменьшения ширины среза от базальной к апикальной части черешка. В частности, у базального среза в самой широкой его части ширина достигает около 3000 мкм. В медиальной части ширина черешка не превышает 2600 мкм. Размеры поперечного сечения постепенно уменьшаются в направлении к листовой пластинке, достигая в апикальной части около 2000 мкм.

Рис. 2.  Анализ геометрической формы очертаний поперечных сечений черешков листа алтея лекарственного: А – срез в базальной части черешка; B – срез в медиальной части черешка; C –  срез в апикальной части черешка.          Обозначения: 1 – шестиугольная форма; 2 – усечение; 3 – округлая форма; 4 – усечение; 5 – треугольная форма; 6 – окружность в ребре среза; 7 – окружность в абаксиальной части. Fig. 2.  Analysis of the geometric shape of the outlines of the cross sections of the petioles of the Althaea officinalis L. leaf: A –  section in the basal part of the petiole; B – section in the medial part of the petiole; C – section in the apical part of the petiole.  Designations: 1 – hexagonal shape; 2 – truncation; 3 – rounded shape; 4 – truncation; 5 – triangular shape; 6 – circle in the edge of the slic; 7 – circle in the abaxial part.

 

 

 

Проводящая система черешка алтея лекарственного устойчивая и слабо изменяется по всей его длине. Начиная с базальной части в черешке диагностируются четыре основных пучка коллатерального типа строения. Два наиболее крупных расположены по центру, их размеры в самой широкой части составляют 700 и 400 мкм соответственно. При этом один пучок смещён к адаксиальной части черешка, а второй — к абаксиальной. Другая пара пучков, имеющая размеры в среднем 300 мкм, располагается по бортам поперечных сечений. В свою очередь, между описанными выше пучками периодически обнаруживаются вторичные пучки меньших размеров (около 150 мкм), непосредственно связанные с иннервацией листа. Как правило, одновременно на поперечном срезе наблюдается совокупность четырёх крупных и четырёх мелких пучков. Этот факт является важной анатомо-гистологической особенностью, возможной к применению для диагностики данного вида сырья.

Армирование черешка сформировано в основном за счет уголковой колленхимы. Колленхима локализована в большей степени с адаксиальной стороны — верхней части черешка, где образует до шести слоёв колленхимных клеток (рис.  4А). Также значительно развита зона колленхимы по рёбрам черешка (рис. 4 F, G). Контрастирование методом поляризационной микроскопии с использованием светового фильтра позволяет увидеть слоистость структуры клеточной стенки в области уголковых утолщений (рис. 4 F). Абаксиальная сторона демонстрирует меньшую толщину механической ткани и представлена всего четырьмя слоями клеток. Колленхимные клетки, варьирующие в размере от 17 до 33 мкм на поперечном сечении, имеют структурированный протопласт в виде капель и аморфных фрагментов желтого или желто-коричневого цвета (рис. 4 F, G).

Помимо колленхимы арматурные функции черешка обеспечивает склеренхима, локализованная по периферии проводящих пучков. Гистологически волокна либриформа в ксилеме и лубяные волокна во флоэмной части пучков диагностируются по сильно утолщенным клеточным стенкам (рис. 3 D). Однако при окрашивании раствором сернокислого анилина характерной реакции на лигнин (рис.3 С), сопровождающейся окрашиванием в желтый цвет, не наблюдается. В проводящих пучках, напротив, лигнифицирование проявляется исключительно у клеточных стенок ксилемных сосудов (рис. 3 A, B, C).

Основной объём черешка заполнен паренхимными изодиаметрическими клетками округлой или овальной формы с гладкими контурами. Размер основных паренхимных клеток варьируется от 12,5 мкм до 62 мкм, увеличиваясь по направлению к центральной части черешка. В основной паренхиме заметны мелкие межклетники. Клеточные стенки паренхимных клеток тонкие целлюлозные. Протопласт слабо выражен и почти не пигментирован. В основной паренхиме по периферии от проводящих пучков локализованы клетки-идиобласты, содержащие слизистые комочки (гетерогенные полимерные комплексы из полисахаридов и гликопротеинов), проявляющиеся по классической окраске с тушью (рис. 4 C, E). Размер данных клеток достигает около 75 мкм и, как правило, они гораздо крупнее размера окружающих клеток паренхимы.

Помимо клеток идиобластов со слизистыми комочками в основной паренхиме, обнаруживаются скопления друз оксалата кальция (рис. 3 A, B, C, D). Эти структуры локализованы преимущественно в зонах, прилегающих к проводящим пучкам, где они формируют чётко выраженные кластеры. Друзы мелкие, имеют устойчивую округлую звёздчатую форму. Размер друз варьируется от 10 мкм до 15 мкм (рис. 3 E, F, G).

 

Рис. 3. Проводящая система и кристаллические включения черешков: А – пучок центральной жилки черешка, окрашенный раствором сернокислого анилина (х 100) ; B – фрагмент ксилемных тканей пучка центральной жилки, окрашенный раствором сернокислого анилина (х 400); C - вторичный пучок с кристаллической обкладкой из друз, окрашенный раствором сернокислого анилина (х 100); D – механические клетки ксилемы и друзы в основной паренхиме вокруг центрального пучка (х 400); E – эпидермис с поверхности черешка в поляризационном свете l (х400); F – друзы в клетках под эпидермисом в поляризационном свете l (х400) ; G – друза в клетке основной паренхимы черешка (х 400).         Fig. 3. Conducting system and crystalline inclusions of petioles: A – a bundle of the central vein of the petiole, colored with a solution of sulfuric acid aniline (x 100); B – a fragment of xylem tissue of the bundle of the central vein, colored with a solution of sulfuric acid aniline (x 400); C - a secondary bundle with a crystalline lining of druze, colored with a solution of sulfuric acid aniline (x 100); D – mechanical xylem cells and druses in the main parenchyma around the central bundle (x400); E – epidermis from the surface of the petiole in polarized light l (x400); F – druses in cells under the epidermis in polarized light l (x400) ; G – druse in the cell of the main parenchyma of the petiole (x 400).

 

Эпидермальные клетки на поперечном сечении мелкие (около 10 мкм) овальной формы. С поверхности они покрыты тонким слоем кутина (1-3 мкм), который становится видимым благодаря интенсивной розовой окраске при обработке раствором Судана III (рис. 4A). Протопласты эпидермальных клеток мелкозернистые и слабопигментированные. При рассмотрении с поверхности на эпидерме изредка встречаются устьичные аппараты аномоцитного типа (рис. 4 D). Устьичные аппараты мелкие и окружены воронкой клеток, отличающихся по форме от клеток основной эпидермы. Клетки основной эпидермы при рассмотрении с поверхности вытянутые почти прямоугольные с зернистым протопластом (рис. 4 D).

 

Рис. 4.  Особенности окраски и поляризации некоторых тканей: А –  кроющие трихомы, окрашенные раствором Судана III с адаксиальной части (х 400); B– железистая трихома, окрашенная раствором Судана III в адаксиальной части черешка; C – слизистые клетки в основной паренхиме черешка (х 400); D – устьичный аппарат с поверхности                                                                        (х400); E – слизистые клетки в основной паренхиме черешка после окрашивания тушью (х 400); F – колленхима в поляризационном свете (х100); G– структура колленхимы в поляризационном свете (х400). Fig. 4.  Peculiarities of coloring and polarization of some tissue:   A – covering trichomes stained with Sudan III solution from the adaxial part (x 400); B – glandular trichome stained with Sudan III solution in the adaxial part of the petiole; C – mucous cells in the main parenchyma of the petiole (x 400); D –   stomatal apparatus from the surface (x400);                         E – mucous cells in the main parenchyma of the petiole after ink staining (x 400); F – collenchyme in polarizing light (x100); G – collenchyme structure in polarizing light (x400).

 

Поверхность черешка сильно опушена, что особенно заметно на его адаксиальной части. Опушение в большей степени составляют кроющие трихомы, представленные простыми одноклеточными волосками длиной от 75 до 200 мкм, собранными в пучки. На поперечном сечении видно, что каждый волосок представляет собой отдельную клетку, расположенную непосредственно с другими клетками трихомы в ряду эпидермальных (рис. 5D). Трихомы представляют собой небольшие пучки по две-четыре клетки (рис. 5 E, G). Клетка кроющей трихомы имеет заметно утолщенную целлюлозную клеточную стенку. Окончание клетки остроконечное (рис. 5 F). Необходимо отметить, что данный тип трихом является характерным для листьев алтея лекарственного и описан в Государственной Фармакопее Российской Федерации XV издания [11], однако в нормативной документации, на наш взгляд, не совсем корректно трактуется его звёздчатый тип. В классической трактовке звездчатые трихомы имеют одну клетку в основании и сильно разветвлённую клетку с поверхности, напоминающую форму звезды. Такие трихомы характерны для представителей семейства Крестоцветные. В нашем случае каждая клетка непосредственно прикрепляется к эпидермису, образуя группу клеток (пучок).

Рис. 5. Особенности трихом на поверхности черешка: А – желёзка на поперечном сечении анфас (х400); B – желёзка на поперечном сечении профиль (х400); C–  желёзка на поперечном сечении вид сверху (х400); D – основание кроющей трихомы на поперечном сечении в поляризационном свете l (х400); E – основание кроющей трихомы вид с поверхности в поляризационном свете l (х400); F – утолщенность клеточной стенки в окончании кроющей трихомы на поперечном сечении в поляризационном свете l (х400); G - основание кроющей трихомы из двух и четырёх клеток, вид с поверхности в поляризационном свете l (х400).       Fig. 5.  Features of the trichomes on the surface of the petiole: A – a piece of iron on the full-face cross-section (x400); B – a piece of iron on the profile cross-section (x400); C – a piece of iron on the top view cross-section (x400; D - the base of the covering trichome on the cross-section in polarized light l (x400); E - the base of the covering trichomes visible from the surface in polarized light l (x400); F- is the thickening of the cell wall at the end of the covering trichome in cross–section in polarized light l (x400); G is the base of the covering trichomes of two and four cells, visible from the surface in polarized light l (x400).

 

Помимо кроющих трихом на эпидермисе встречаются желёзки. Структура желёзок при рассмотрении на поперечном сечении представлена одноклеточной ножкой и многоклеточной   двурядной головкой вытянутой формы (рис. 5 A, B, C). Желёзки мелкие (около 40 мкм), вытянутой овальной формы. При обработке среза раствором Судана III головки желёзок окрашиваются в розовой цвет, что свидетельствует о наличии липофильных соединений (рис. 4B). Необходимо отметить, что в Фармакопейной статье Государственной Фармакопеи Российской Федерации XV издания данный тип трихом на эпидерме листа трактуется, как железистый волосок.

Выводы. Таким образом, в результате проведенного анатомо-морфологического исследования были выявлены новые и подтверждены ранее описанные диагностические особенности листьев алтея лекарственного, заключающиеся в комплексе следующих признаков:

1.Вариабельность очертаний поперечных сечений черешка. Базальная часть характеризуется треугольным контуром поперечного среза с округлыми углами между гранями. Медиальная часть имеет меньшие размеры и характер геометрического очертания. Апикальный срез отличается угловатыми очертаниями и выраженным волнистым характером поверхности.

2. Характерное строение и расположение проводящих пучков коллатерального типа. Как правило, одновременно на поперечном срезе наблюдается совокупность четырех крупных и четырех мелких пучков.
3. Расположение колленхимы уголково-пластинчатого типа по всему периметру поперечного среза, локализованной в большей степени по ребрам черешка, где она насчитывает до шести рядов клеток.
4. Присутствие друз оксалата кальция и клеток идиобластов со слизистыми комочками в основной паренхиме.
5. Характерное опушение, представленное кроющими трихомами в виде простых одноклеточных волосков на эпидермисе, собранными в пучки по две или четыре клетки.
6. Наличие желёзок, структурно представленных одноклеточной ножкой и многоклеточной двухрядной головкой вытянутой формы.

Выявленные морфологические признаки листьев и уникальные характеристики строения черешков представляют собой специфические видовые особенности алтея лекарственного, которые целесообразно использовать в качестве диагностической особенности в целях подтверждения подлинности лекарственного растительного сырья «Алтея лекарственного трава» и отличия его от примесных видов.

Заключение. В ходе микроскопического анализа черешков алтея лекарственного (Althaea officinalis L.)  семейства Мальвовые (Malvaceae) были установлены ключевые морфолого-анатомические признаки, значимые для диагностики данного вида, что подтверждают фотоматериалы, представленные в работе. Исследование позволило систематизировать данные о строении черешков и выявить новые диагностические маркеры алтея лекарственного. Наиболее значимыми для стандартизации сырья, с нашей точки зрения, оказались: очертания формы черешков в различных местах среза, характерное расположение и количество проводящих пучков коллатерального типа, специфичное строение кроющих трихом и железок. Их не совсем полное, на наш взгляд, описание в фармакопее может привести к затруднениям в вопросах идентификации лекарственного растительного сырья. Это подчеркивает потенциал петиолярной анатомии как инструмента для детального анализа структурных элементов растений.

Полученные данные расширяют данные раздела «Микроскопические признаки» действующей фармакопейной статьи «Трава алтея лекарственного» и обосновывают необходимость углубленного изучения надземных органов представителей рода Алтей (Althaea). Результаты могут быть использованы как при актуализации нормативов на данное лекарственное растительное сырье, так и в фундаментальной ботанике для изучения представителей семейства Malvaceae. Перспективным направлением исследований является сравнительный анализ петиолярных признаков у других видов рода Althaea, что может дополнить таксономическую характеристику обширной группы Malvaceae.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

 

Об авторах

Татьяна Геннадьевна Радомская

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: Tatyanashko@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0003-1996-0159
SPIN-код: 5443-4531

Аспирант кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Россия, 443099, Самарская область, г. Самара, ул. Чапаевская, д. 89

Никита Павлович Егоров

Email: n.egorov.2000@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-2349-1865
Россия

Виталий Михайлович Рыжов

Самарский государственный медицинский университет

Email: lavr_rvm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8399-9328

доцент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ, кандидат фармацевтических наук

Россия

Владимир Александрович Куркин

ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: v.a.kurkin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7513-9352

профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, доктор фармацевтических наук

Россия, 443099, Самара, ул. Чапаевская, д. 89

Валерий Борисович Браславский

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: v.b.braslavskii@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6681-6107

доктор фармацевтических наук, доцент, доцент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы