Методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках Acer tataricum L.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

 Род Клен (Acer L.) относится к семейству Кленовые (Aceraceae), включающий около 129 видов, распространённых преимущественно в умеренных широтах Северного полушария (Восточная Азия, Северная Америка, Европа). Многие виды клёна на протяжении веков применяются в народной медицине для лечения различных заболеваний [1]. Экстракты различных видов клена (Acer) на протяжении длительного времени применяются в традиционной медицине в связи с их широким спектром фармакологической активности, включающей антиоксидантное, противовоспалительное, гипогликемическое, гепатопротекторное и потенциальное антиканцерогенное действие [1]. Данные эффекты могут быть обусловлены наличием разнообразных биологически активных соединений в их составе [1].

Клен татарский (Acer tataricum L.), также известный как черноклен, представляет собой листопадное древовидное растение или крупный кустарник, достигающий высоты 8 метров. Ареал его распространения охватывает регионы Центральной, Восточной и Юго-Восточной Европы, Малой Азии, а также Кавказ [2-4].

Клён татарский имеет химический состав, включающий разнообразные биологически активные вещества. Основную группу составляют фенольные соединения, которые определяют фармакологические свойства растения, в частности его противомикробную активность. В листьях клёна татарского содержатся фенольные соединения (включая метилгаллат, дубильные вещества), циклитолы (например, квебрахит), сапонины [5].

Цель

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для разработки методики применяли цветки клёна татарского, собранные в лесном массиве «Дубки» (район Сокольи Горы, г. Самара). Сушку растительного сырья проводили в естественных условиях при комнатной температуре, без воздействия прямого солнечного света.

В качестве метода исследования использована прямая и дифференциальная спектрофотометрия в соответствии ОФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» ГФ РФ XV издания [6]. Спектральные характеристики водно-спиртовых извлечений оценивали на спектрофотометре Specord 40 (AnalytikJena AG, Германия) в диапазоне длин волн 190-500 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнительное изучение УФ-спектров водно-спиртовых извлечений из цветов клена татарского и раствора рутина (рисунок 1-4) показало, что в обоих случаях наблюдается батохромный сдвиг в длинноволновом области УФ-спектров в присутствии AlCl₃ при 412 ±2 нм, что характерно для рутина [7-10]. В соответствии с этим разработанная методика основана на реакции комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия (AlCl₃) с использованием в качестве стандартного образца (СО) рутина и аналитической длины волны 412 нм.

Рисунок 1. УФ-спектры раствора водно-спиртового извлечения из цветков клена татарского (1) и раствора водно-спиртового извлечения из листьев клена татарского с добавлением алюминия хлорида (2)

Рисунок 2. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из цветков клена татарского (дифференциальный спектр)

Рисунок 3. УФ-спектры раствора рутина (1) и раствора с добавлением алюминия хлорида (2)

Рисунок 4. УФ-спектр раствора рутина (дифференциальный спектр)

В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из цветков клена татарского в дифференциальном варианте обнаруживается максимум поглощения при длине волны 412 нм (рисунок 4), который близок к максимуму спиртового раствора рутина (рисунок 2) [7-10]. Для количественного определения флавоноидных соединений были оптимизированы условия экстракции: в качестве экстрагента использовали 70% этанол, соотношение «сырье: экстрагент» составило 1:50, степень измельчения 2 мм, продолжительность экстракции – 45 мин при нагревании на водяной бане с обратным холодильником (таблица 1).

 

№	Экстрагент	Соотношение «сырье- экстрагент»	Время экстракции, мин	Степень измельчения, мм	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье (в %)
Экстрагент
1	этиловый спирт 40%	1:50	45	2	1,62 ± 0,04%
2	этиловый спирт 50%				1,65 ± 0,05%
3	этиловый спирт 60%				1,76 ± 0,05%
4	этиловый спирт 70%				2,01± 0,05%
5	этиловый спирт 80%				1,82± 0,04%
6	этиловый спирт 90%				1,80± 0,05%
7	этиловый спирт 96%				1,75± 0,05%
Время экстракции
8	70 % этиловый спирт	1:50	30	2	1,85± 0,04%
9			45		2,29± 0,05%
10			60		1,89± 0,04%
11			90		1,75± 0,04%
Степень измельчения
12	70 % этиловый спирт	1:50	45	1	1,85± 0,04%
13				2	1,92± 0,05%
14				3	1,86± 0,04%
Соотношение «сырье-экстрагент»
15	70 % этиловый спирт	1:20	45	2	1,82± 0,05%
16		1:30			1,87± 0,05%
17		1:50			1,90± 0,05%

 

Таблица 1. Влияние различных факторов на полноту извлечения флавоноидов из цветков клена татарского

Методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления. В качестве раствора сравнения раствор, используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1:25) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки.

Приготовление раствора стандартного образца рутина.

Около 0,0048 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью
25 мл, растворяют в 15 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутин). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б рутина). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым
96 % (раствор сравнения Б рутина). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

X = (A * mo ∙50 ∙25 ∙1∙ 100∙ 100)/( Ao* m *1* 25 *25 (100-W)),

где A – оптическая плотность испытуемого раствора; A_o – оптическая плотность раствора СО рутина; m – масса сырья, г; m_о – масса СО рутина, г; W – потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия СО рутина целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 412 нм – 240 [11].

x=(A ×50× 25 ×100)/(m ×240 (100-W)),

где A – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 240 – удельный показатель поглощения (E) СО рутина при 412 нм; W – потеря в массе при высушивании, %.

Критерием оценки аналитической методики является валидационная оценка [6, 12-15]. Валидацию методики проводили в соответствии с ГФ РФ XV издания [6].

Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность.

Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов листьев клена татарского и раствора СО рутина с алюминием хлоридом (дифференциальный вариант).

Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,008 до 0,038 мг/мл) с алюминием хлоридом при длине волны 412 нм. На основании полученных данных строили график зависимости значений оптической плотности растворов рутина с алюминием хлоридом от концентрации рутина и затем рассчитывали уравнение линейной регрессии (рисунок 5; таблица 2).

При изучении линейной зависимости вида y = bx + a, коэффициент корреляции составил 1, следовательно, данную методику можно использовать для анализа суммы флавоноидов в листьях клена татарского в пересчете на рутин в указанном диапазоне концентраций (рисунок 5; таблица 2).

 

№ п/п	Концентрация раствора стандартного образца рутина, мг/мл	Значение оптической плотности, е.о.п. (среднее значение из трех последовательных измерений)
1	0,008	0,1641
2	0,015	0,3316
3	0,023	0,4856
4	0,038	0,8118

 

Таблица 2.  Исходные данные для оценки линейности методики

Рисунок 5. Зависимость значений оптической плотности раствора рутина с алюминия хлоридом от концентрации рутина (дифференциальный вариант)

Метрологические характеристики методик количественного определения содержания суммы флавоноидов в водно-спиртовом извлечении цветков клена татарского представлены в таблице 3. Ошибка единичного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского с доверительной вероятностью 95% составляет ±1,67% (таблица 3).

 

n	f	,%	S2	S		P, %	t (P, f)	±∆X	±∆	E, %	, %
11	10	1,90	0,0010	0,0319	0,014	95	2,23	±0,07	±0,03	±1,67	±3,74

 

Таблица 3.  Результаты оценки прецизионности методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского (уровень повторяемости)

Таким образом, исходя из результатов валидационной оценки результатов эксперимента, можно сделать вывод о пригодности использования данной методики для количественной оценки суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

С использованием этой методики было проанализировано четыре образца цветков клена татарского, заготовленных в летний период. Определено, что содержание суммы флавоноидов в анализируемых образцах, собранных в Самарской области, варьирует от 1,89%±0,05% до 2,01%±0,05% в зависимости от месяца сбора растительного сырья (таблица 4). На наш взгляд, для   обоснования числового показателя – суммы флавоноидов в цветках клена татарского целесообразно проведение дальнейших исследований на примере образцов сырья из других регионов Российской Федерации.

№	Характеристика образца сырья	Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (в %) в пересчете на рутин
1.	Лесной массив «Дубки» в районе Сокольих Гор г. Самара (июнь 2025 г.) Дата сбора: 06.06.2025 г.	1,89±0,05%
2.	Лесной массив «Дубки» в районе Сокольих Гор г. Самара (июнь 2025 г.) Дата сбора: 13.06.2025 г.	2,01±0,05%
3.	Лесной массив «Дубки» в районе Сокольих Гор г. Самара (июнь 2025 г.) Дата сбора: 21.06.2025 г.	1,95±0,05%

Таблица 4. Содержание суммы флавоноидов в образцах цветков клена татарского (в %) в пересчете на рутин

Выводы

Таким образом, в результате проведенного исследования разработана методики количественного анализа суммы флавоноидов в цветках клена татарского с использованием СО рутина  при аналитической длине волне 412 нм. Определено, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках клена татарского, собранных в Самарской области,  варьируется от 1,89%±0,05% до 2,01%±0,05%. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±1,67%.

Проведена валидационная оценка разработанной методики по показателям специфичность, линейность в соответствии с ГФ РФ XV издания. Исходя из результатов валидационной оценки результатов эксперимента, можно говорить о пригодности использования данной методики для количественной оценки суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках клена татарского.

Полученные результаты исследования могут быть использованы при разработке нормативной документации на перспективный вид лекарственного растительного сырья «Клена татарского цветки» для внедрения в Государственную фармакопею Российской Федерации.

Об авторах

Комила Рафаильевна Хозинова

Самарский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: kamilahozinova@gmail.com
ORCID iD: 0009-0007-8581-8563

Аспирант

Россия

Владимир Александрович Куркин

ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России

Email: v.a.kurkin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7513-9352

профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, Доктор фармацевтических наук

Россия, 443099, Самара, ул. Чапаевская, д. 89

Список литературы

Дополнительные файлы