Количественное определение суммы фенольных соединений и флавоноидов в листьях голубики высокорослой

Полный текст

Введение

Интерес к лекарственным средствам и биологически активным добавкам, полученным путем полной или частичной переработки лекарственного растительного сырья, обусловлен рядом их преимуществ: относительная безопасность, комплексное воздействие на органы и системы человеческого организма, широкий спектр фармакологического действия, возможность длительного применения, ценовая доступность. Поэтому является актуальной разработка новых лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья [1, 2].

Голубика высокорослая (Vaccinium corymbosum) – ягодный ветвистый кустарник семейства Ericaceaе, широко культивируемый на всей территории Республики Беларусь. Данный вид существенно отличается от дикорастущего вида – голубики топяной (Vaccinium uliginosum), превосходя ее по высоте кустарника, урожайности и вкусовым качествам плодов [3]. Фармакологические свойства голубики обуславливаются высокой способностью к накоплению фенольных соединений (антоцианов, флавоноидов, процианидинов, ГКК) и аддитивным взаимодействием биологически активных веществ. В традиционной медицине голубика применяется для лечения сахарного диабета, и его осложнений, заболеваний сердечно-сосудистой системы, снижения артериального давления, восстановления зрительной функции [4-6].

            Постоянный рост спроса на плоды голубики привел к увеличению объёмов культивирования растения в промышленных масштабах не только на территории Республики Беларусь, но и во всем мире. Большое разнообразие сортов, в том числе и голубики высокорослой с устойчивостью к морозам до -30 °С, делает возможным и выгодным ее культивирование в условиях Республики Беларусь. Разработан отраслевой технологический регламент производства голубики высокорослой с расчетной урожайностью 7–10 т/га [7-9]. Следовательно, создана хорошая основа для развития промышленной культуры голубики в Республике Беларусь.

Листья голубики высокорослой являются побочным продуктом переработки с большой сырьевой массой и могут служить альтернативным источником биологически активных веществ для разработки новых растительных биологически активных добавок антидиабетического действия, что повысит экономическую эффективность процесса культивирования. Однако в Республике Беларусь не разработана нормативная документация для стандартизации листьев голубики высокорослой, что объясняет актуальность изучения данного растения.

            Один из этапов стандартизации является изучение химического состава и разработка методик количественного определения (КО) биологически активных веществ [10]. Преимуществом спектрофотометрического метода определения суммы фенольных соединений (ФС) и флавоноидов является простота, доступность, достаточно высокая воспроизводимость и возможность модифицирования метода [11, 12].

 

 

Цель

Разработка методик количественного определения суммы фенольных соединений и флавоноидов в листьях голубики высокорослой.

Материал и методы

Объектом исследования являлись листья голубики высокорослой, заготовленные в августе 2024 года. Сбор осуществлялся в сухую погоду, после схода росы. Сушка листьев проводилась воздушно-теневым способом при комнатной температуре в хорошо вентилируемых помещениях без доступа прямых солнечных лучей.

Количественную оценку действующих веществ в листьях голубики высокорослой проводили по суммарному содержанию ФС и флавоноидов в пересчете на гиперозид, так как данные группы биологически активных веществ являются основными в исследуемом сырье. Содержание суммы ФС и флавоноидов в пересчете на гиперозид определяли спектрофотометрически с реактивом Folin-Ciocalteu (фосфорномолибденововольфрамовый реактив) и с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида соответственно.

Измерения проводили в пяти независимых повторностях на одном образце сырья.

Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Solar PB2201.

Результаты и их обсуждение

Для выбора оптимальных условий экстрагирования было последовательно определено влияние на полноту извлечения суммы ФС и флавоноидов из листьев голубики высокорослой следующих факторов:

1. Концентрация этанола (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 96%);
2. Время нагревания на водяной бане (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 минут);
3. Соотношение сырье-экстрагент (1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:100);
4. Степень измельченности (180, 355, 500, 1400, 2000, 5000);

На первом этапе изучали зависимость полноты извлечения суммы ФС и флавоноидов из листьев голубики высокорослой от концентрации спирта (рисунок 1).

Рисунок 1. Содержание суммы ФС и флавоноидов в спиртовых извлечениях из листьев голубики высокорослой

Figure 1. The content of the sum of FS and flavonoids in alcoholic extracts from highbush blueberry leaves

 

Использование в качестве экстрагента 10% и 60% спирта этилового обеспечивало максимальное извлечение суммы ФС (10% – 17,56±0,16%, 60% – 18,05±0,61%) и флавоноидов (10% – 2,57±0,16%, 60% – 2,73±0,11%). Не выявлено статистически достоверных отличий (p<0,05) между содержанием ФС и флавоноидов в извлечениях, полученных путем экстракции спиртом 10% и 60%: t_эксп<t_крит; t_крит (P=0,95; ν = 8) = 2,31, t_эксп  = 1,50 для суммы ФС  и t_эксп  = 0,20 для суммы флавоноидов. Однако этанол в низких концентрациях в растворах катализирует процессы гидролиза, окисления и не проявляет антимикробную активность, поэтому такие извлечения менее стабильны и имеют ограниченный срок хранения. Исходя из этого, в разработанной методике количественного определения суммы ФС и флавоноидов в листьях голубики высокорослой в качестве экстрагента использовали 60% спирт этиловый. 

На втором этапе исследования изучали влияние продолжительности экстракции на извлечение суммы ФС и флавоноидов из листьев голубики высокорослой (рисунок 2).

Рисунок 2. Зависимость содержания суммы ФС и флавоноидов в получаемых извлечениях от времени экстракции

Figure 2. Dependence of the content of the sum of FS and flavonoids in the obtained extracts on the extraction time

 

Из рисунка видно, с увеличением продолжительности экстракции наблюдалось увеличение содержания ФС и флавоноидов в получаемых извлечениях, при этом максимальная экстракция биологически активных веществ достигалась к 50 минуте (ФС –21,74±0,24%, флавоноидов – 2,89±0,37%). Дальнейшее увеличение продолжительности приводило к снижению эффективности экстракции. На основании этого в разработанной методике количественного определения суммы ФС и флавоноидов в листьях голубики проводили экстракцию в течение 50 минут.

На третьем этапе изучали зависимость содержания суммы ФС и флавоноидов в извлечениях от соотношения массы сырья к объёму экстрагента (рисунок 3).

Рисунок 3. Влияние соотношения массы сырья к объёму экстрагента

на извлечения суммы ФС и флавоноидов из листьев голубики высокорослой

Figure 3. The influence of the ratio of raw material mass to extractant volume on the extraction of the total FS and flavonoids from highbush blueberry leaves

 

            Максимальное содержание суммы ФС и флавоноидов наблюдалось при соотношении сырья и экстрагента 1:100 (ФС – 20,74±0,72; флавоноиды – 3,43±0,18). Минимум экстракции наблюдался при соотношении сырьё-экстрагент 1:10 (10,78±0,57% для ФС, 1,56±0,09% для флавоноидов). Такой характер экстракции можно объяснить тем, что ограниченный объём растворителя обеспечивал недостаточную степень сольватации и диффузии действующих веществ в экстрагент. В дальнейшем анализе использовали соотношение сырьё-экстрагент 1:100.

            Результаты изучения влияния степени измельчённости порошка листьев голубики высокорослой на эффективность экстракции суммы ФС и флавоноидов представлены на рисунке 4 (четвертый этап подбора оптимальных условий экстракции).

Рисунок 4. Зависимость полноты экстракции суммы ФС и флавоноидов от степени измельченности порошка листьев голубики высокорослой

Figure 4. Dependence of the completeness of extraction of the sum of FS and flavonoids on the degree of grinding of highbush blueberry leaf powder

 

Из графика видно, что с уменьшением размера частиц наблюдается увеличение содержания суммы ФС и флавоноидов в получаемых извлечениях. Максимальный выход суммы ФС и флавоноидов наблюдался при использовании сырья, состоящего из частиц, проходящих сквозь сито (355) (ФС – 22,27±0,20%, флавоноиды – 2,41±0,13%), что связано с большей площадью соприкосновения частиц твердой фазы с растворителем и более интенсивным протеканием процесса диффузии действующих веществ из измельченного сырья. Использование порошка сырья с меньшей степенью измельчённости для аналитических целей нежелательно вследствие образования устойчивой суспензии. Исходя из этого, в разработанных методиках количественного определения ФС и флавоноидов в листьях голубики высокорослой использовали порошок сырья, состоящего из частиц, проходящих сквозь сито (355).

Таким образом, в качестве оптимальных условий для количественного определения суммы ФС и флавоноидов из листьев голубики высокорослой были выбраны следующие:

1. экстрагент – этиловый спирт 60%;
2. время экстракции – 50 мин;
3. соотношение сырье:экстрагент – 1:100;
4. степень измельчения сырья – 355.

При подборе оптимальных факторов проведения реакции комплексообразования ФС с реактивом Folin-Ciocalteu (фосфорномолибденово-вольфрамовым) и флавоноидов с 2% раствором алюминия хлорида, установили влияние объёма добавляемого реактива, времени протекания реакции, концентрации раствора натрия карбоната (для ФС) на значения оптической плотности системы.

            Установили «точку насыщения» – минимальный промежуток времени, за который достигнуто максимальное значение оптической плотности (рисунок 5).

Рисунок 5. Влияние времени протекания реакции на значение оптической плотности (А)

Figure 5. The effect of reaction time on the optical density value (A)

 

Максимальное значение оптической плотности наблюдалось через 50 мин после начала реакции и оставалось стабильным в течение последующих 30 мин, что указывало на стабильность продуктов реакции и полное вступление ФС во взаимодействие с реактивом Folin- Ciocalteu и флавоноидов с раствором алюминия хлорида. Поэтому в разработанных методиках количественного определения суммы ФС и флавоноидов в листьях голубики высокорослой оптическую плотность анализируемых растворов измеряли через 50 мин после их приготовления.

Установили влияние объёма добавляемого реактива Folin-Ciocalteu, а также концентрации раствора натрия карбоната на значение оптической плотности получаемых растворов (таблица 1).

 

Испытуемый параметр	Значение оптической плотности (А)
1.      Концентрация раствора натрия карбоната, % 3 5 10 20 30	0,597±0,07 0,701±0,02 0,642±0,01 0,637±0,05 0,635±0,05
2.      Объём реактива Folin- Ciocalteu, мл 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7	0,458±0,05 0,605±0,06 0,627±0,03 0,651±0,07 0,697±0,09 0,682±0,08 0,669±0,03

Таблица 1. Условия реакции комплексообразования суммы ФС из листьев голубики высокорослой с реактивом Folin- Ciocalteu

Table 1. Conditions of the reaction of complexation of the sum of FS from highbush blueberry leaves with the Folin-Ciocalteu reagent

 

Из таблицы видно, что при добавлении к определенному объёму исследуемого образца 0,5 мл и более реактива Folin- Ciocalteu значение оптической плотности практически не изменялось, что указывало на полное вступление ФС во взаимодействие с реактивом. Поэтому данный объём реактива будет использован в дальнейшем для количественного определения суммы ФС в листьях голубики высокорослой.

            Из таблицы 1 видно, что оптимальным для протекания реакции взаимодействия ФС с реактивом Folin- Ciocalteu является использование 5% раствора натрия карбоната, увеличение его концентрации приводило к снижению оптической плотности. Поэтому в методике количественного определения суммы ФС в листьях голубики использовали 5% раствор натрия карбоната.

            Установили минимальный объём 2% спиртового раствора алюминия хлорида, который необходим для взаимодействия всех флавоноидов в извлечении из листьев голубики высокорослой (рисунок 6).

Рисунок 6. Влияние объёма добавляемого раствора алюминия хлорида на значение оптической плотности (А)

Figure 6. Effect of the volume of added aluminum chloride solution on the optical density value (A)

 

            Из рисунка 6 видно, что максимальное значение оптической плотности наблюдалось при добавлении 2,0 мл 2% раствора алюминия хлорида к реакционной смеси. При дальнейшем увеличении объёма реактива значение оптической плотности практически не изменялось, что указывало на полное вступление флавоноидов во взаимодействие с реактивом. Поэтому в разработанной методике количественного определения флавоноидов из листьев голубики использовали 2,0 мл 2% раствора алюминия хлорида.

            Таким образом, подобраны оптимальные условия проведения реакции комплексообразования, обеспечивающие максимально полное вступление ФС во взоимодействие с реактивом Folin- Ciocalteu и флавоноидов с раствором алюминия хлорида: время реакции – 50 минут, концентрация раствора натрия карбоната – 5%, объём реактива Folin- Ciocalteu – 0,5 мл, объем 2% спиртового раствора алюминия хлорида – 2 мл.  

            После подбора оптимальных условий экстракции и проведения реакции комплексообразования ФС с реактивом Folin- Ciocalteu и флавоноидов с раствором алюминия хлорида для стандартизации листьев голубики высокорослой предложены методики количественного определения суммы ФС и флавоноидов в пересчете на гиперозид (таблица 2).

 

	КО суммы ФС	КО суммы флавоноидов
Получение извлечения из листьев голубики высокорослой	1,000 г измельченных листьев голубики (355) помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляют 100 мл 60% спирта этилового. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 50 минут, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры и фильтруют (раствор А)
Испытуемый раствор	В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 0,1 мл раствора А, прибавляют 0,5 мл реактива Folin-Ciocalteu, 10 мл воды очищенной и доводят объем раствора до метки 5% раствором натрия карбоната.	В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл полученного извлечения, прибавляют 2 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, 1 каплю кислоты уксусной разведенной и доводят объем раствора спиртом этиловым 60% до метки.
Компенсационный раствор	В мерную колбу объемом 25 мл помещают 0,5 мл реактива Folin-Ciocalteu, 10 мл воды очищенной и доводят объем раствора до метки 5% раствором натрия карбоната	В колбу объемом 25 мл помещают 1 мл извлечения, каплю раствора уксусной кислоты разбавленной и доводят до 25 мл этиловым спиртом (60%).
Время реакции	50 минут	50 минут
Длина волны	710 нм	410 нм

Таблица 2. Методики количественного определения суммы ФС и флавоноидов в пересчете на гиперозид.

Table 2. Methods for quantitative determination of the sum of FS and flavonoids in terms of hyperoside.

 

Концентрацию суммы ФС и флавоноидов в испытуемом растворе (мг/мл) в пересчете на гиперозид определяли по градуировочному графику.

            Построение градуировочного графика. 0,01 г гиперозида в пересчете на сухое вещество помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл и растворяли в этиловом спирте 60%, доводили объем раствора этиловым спиртом 60% до метки. Из исходного раствора готовили ряд разведений с концентрацией гиперозида 0,75 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл. Для количественного определения суммы ФС в мерные колбы отбирают по 0,1 мл полученных растворов, для количественного определения суммы флавоноидов – по 1 мл. Далее проводили реакции комплексообразования согласно методикам, приведенным выше.

            По результатам измерения оптической плотности растворов строили градуировочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию гиперозида в мг/мл, на оси ординат - оптическую плотность раствора (таблица 3).

 

Методика КО суммы ФС	Методика КО суммы флавоноидов

Таблица 3. Градуировочный график по гиперозиду для количественного определения суммы ФС и флавоноидов в листьях голубики высокорослой

Table 3. Calibration graph for hyperoside for quantitative determination of the sum of PC and flavonoids in highbush blueberry leaves

 

Содержание суммы ФС или флавоноидов (Х,%) в пересчете на гиперозид и на абсолютно сухое сырье в листьях голубики высокорослой вычисляли по формуле 1:

где С – содержание ФС или флавоноидов в пересчете на гиперозид, найденное по градуировочному графику мг/мл;

V – объём, полученного экстракта, мл;

m – масса навески испытуемого сырья, г;

 – потеря в массе при высушивании, %.

             Следующим этапом разработки методик количественного определения суммы ФС и флавоноидов в листьях голубики высокорослой являлось проведение валидации в соответствии с требованиями ГФ РБ II издание, том 1 (статья № 5.3.2) по показателям: линейность, точность (по критериям сходимость (повторяемость), внутрилабораторная точность), правильность, робастность.

            Линейность методики определяли путем трехкратного построения градуировочного графика. Растворы готовили путем увеличения аликвоты экстракта от 0,1 мл до 2 мл (таблица 4).

 

Методика КО суммы ФС	Методика КО суммы флавоноидов

Таблица 4. Валидация методик количественного определения суммы ФС и флавоноидов по показателю линейность

Table 4. Validation of methods for quantitative determination of the amount of FS and flavonoids based on the linearity indicator

 

Из таблицы 4 видно, что градуировочные графики для обеих методик линейны. При расчете параметров линейной зависимости для методики количественного определения ФС установлено, что S₀² = 0,02 статистически значимо не отличалось (F_эксп < F_крит ; F_крит (P=0,95; ν =2) = 18,51 и F_эксп = 3,20) от S_y² = 0,06, для методики количественного определения флавоноидов – S₀² = 0,001 статистически значимо не отличалось (F_эксп < F_крит ; F_крит (P=0,95; ν =2) = 18,51 и F_эксп = 11,87) от S_y² = 0,017. Полученные данные указывали об адекватности обработки данных с помощью уравнений, приведенных в таблице 4.  

Точность методик количественного определения суммы ФС и флавоноидов в листьях голубики высокорослой оценивали на двух уровнях: сходимость и внутрилабораторная точность.

Сходимость результатов количественного определения были установлены на основании анализа одного образца сырья в десяти независимых повторностях (таблица 5).

 

КО суммы ФС
X̅, %	n	S²	S	Sx̅	Sr	t (P, ν)	∆ x̅	ɛ̅, %
20,45	10	0,27	0,52	0,17	0,03	2,26	0,39	1,90
КО суммы флавоноидов
X̅, %	n	S²	S	Sx̅	Sr	t (P, ν)	∆ x̅	ɛ̅, %
1,93	10	0,02	0,10	0,03	0,05	2,26	0,08	3,24

Таблица 5. Метрологические характеристики методик количественного определения суммы ФС и флавоноидов в пересчете на гиперозид в листьях голубики высокорослой

Table 5. Metrological characteristics of methods for quantitative determination of the sum of FS and flavonoids in terms of hyperoside in highbush blueberry leaves

 

Из таблицы 5 следует, что относительная ошибка при доверительной вероятности 95% составляла 1,90% и 3,24% при количественном определении суммы ФС и флавоноидов соответственно. В связи с этим разработанные методики позволяли с высокой точностью определить содержание суммы ФС и флавоноидов в листьях голубики высокорослой.

При определении внутрилабораторной точности оценивали влияние проведения анализов в разные дни в течение пяти рабочих дней (фактор 1), замены аналитиков (фактор 2) на результаты количественного определения суммы ФС и флавоноидов (таблица 6).

 

КО	Фактор	S	RSD, %	∆ x̅
Сумма ФС	1	0,23	1,18	0,18
	2	0,25	1,27	0,19
Сумма флавоноидов	1	0,07	0,97	0,05
	2	0,10	1,56	0,08

Таблица 6. Внутрилабораторная точность методик количественного определения суммы ФС и флавоноидов

Table 6. Intralaboratory accuracy of methods for quantitative determination of the amount of FS and flavonoids

 

Из таблицы 6 видно, что относительное стандартное отклонение менее 5%, исходя из этого существенных различий по воспроизводимости методик не обнаружено.

Методом стандартных добавок (стандартный образец гиперозида) оценивали правильность методик количественного определения суммы ФС и флавоноидов (таблица 7).

 

БАВ	Содержание БАВ в получаемом извлечении, мг/мл	Добавлено гиперозид, мг/мл	Обнаружено БАВ, мг/мл	Обнаружено, %	Воспроизво-димость (RSD, %)
Сумма ФС	1,94	0,1	2,10	103	4,1
	1,94	0,3	2,20	98	1,75
	1,94	0,5	2,47	100	2,32
Сумма флавоноидов	0,18	0,1	0,29	103	3,36
	0,18	0,3	0,43	90	3,74
	0,18	0,5	0,64	94	3,05

Таблица 7. Правильность методик количественного определения суммы ФС и флавоноидов (P = 0,95; n = 3)

Table 7. The accuracy of the methods for quantitative determination of the amount of FS and flavonoids (P = 0.95; n = 3)

 

Из таблицы 7 следует, что разработанные методики соответствовали установленному критерию приемлемости – 85-115%.

Методики количественного определения суммы ФС и флавоноидов по показателю робастность оценивали путем изменения концентрации спирта этилового (60±5%), времени экстракции (50±5 мин) и протекания реакции (50±5 мин). При измерении оптической плотности до и после изменения указанных параметров не было выявлено статистически значимых различий в полученных результатах (100±5% отн.).

 

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия экстракции суммы фенольных соединений и флавоноидов из листьев голубики высокорослой (экстрагент – 60% спирт этиловый, время экстракции – 50 минут, соотношение сырьё:экстрагент – 1:100, степень измельченности – 355) и оптимальные факторы протекания химических реакций взаимодействия ФС с реактивом FolinCiocalteu (время реакции – 50 минут, концентрация карбоната натрия – 5%, количество добавляемого реактива – 0,5 мл), флавоноидов с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида (время реакции – 50 минут, объём реактива – 2 мл).
2. Разработаны и валидированы методики количественного определения суммы ФС и флавоноидов в пересчете на гиперозид в листьях голубики высокорослой. Содержание ФС составляло в среднем – 20,45%, флавоноидов – 1,93%. Относительная ошибка при доверительной вероятности 95% КО суммы ФС – 1,90%, суммы флавоноидов – 3,24%.

Об авторах

Анна Витальевна Счастная

Учреждение образования "Белорусский государственный медицинский университет"

Автор, ответственный за переписку.
Email: anna.schastnaya.schastnaya@mail.ru

Ассистент кафедры организации фармации с курсом повышения квалификации и переподготовки

Белоруссия

О. В. Мушкина

Учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет»

Email: olga7081@tut.by
ORCID iD: 0000-0002-3397-1220

канд. фарм. наук, доцент, заведующая кафедрой организации фармации с курсом повышения квалификации и переподготовки

Белоруссия, Минск

Список литературы

Дополнительные файлы