Структурное разнообразие и свойства углеводсодержащих биополимеров морских грамотрицательных бактерий

Полный текст

Введение

С момента возникновения жизни на Земле океаны нашей планеты выступают в качестве источника биологического разнообразия и двигателя эволюции. Около 70–90 % биомассы морей и океанов составляют микроорганизмы. Действительно, Мировой океан – самый обширный и наименее изученный биотоп на планете Земля, где грамотрицательные бактерии являются неотъемлемым компонентом и представляют значительную часть микробных сообществ. Как древнейший на Земле, микробиом океана включает особые, иногда лишь ему присущие таксоны микроорганизмов, которые формировались на протяжении длительного периода эволюции. Ареалы грамотрицательных бактерий весьма разнообразны и охватывают прибрежные и открытые акватории океанов, глубоководные и гидротермальные впадины, грунты, некоторые виды бактерий способны колонизировать внешние оболочки и внутренние поверхности морских животных и растений. Отдельные группы микроорганизмов образуют высокоспецифичные симбиотические взаимосвязи с организмом хозяина [1]. В большей части морской среды обитания преобладают низкие концентрации питательных веществ, низкие температуры, высокое гидростатическое давление, повышенная соленость, и выживание в этих условиях требует сложного набора морфологических, физиологических и метаболических адаптивных стратегий. Специфические, а порой и экстремальные, условия обитания морских микроорганизмов сформировали у них ряд приспособительных особенностей. Разумно предположить, что изменения коснулись и биополимеров клеточной стенки бактерий, которые играют определяющую роль во взаимодействии микроорганизмов с окружающей средой. Именно структура этих жизнеобеспечивающих молекул является отражением функциональных изменений, вызванных суровой средой обитания.

Большинство грамотрицательных бактерий снаружи покрыты специфическим типом гликоконъюгатов – липополисахаридами (ЛПС). ЛПС представляет собой основной компонент внешней мембраны клеточной стенки, играя важнейшую роль в защите микроорганизмов от стрессовых факторов окружающей среды, в устойчивости к антибиотикам и токсинам, в патогенезе и симбиозе [2]. Этот липогликан обычно имеет трехдоменную структурную организацию и состоит из липида А (гидрофобная часть, которая закрепляет молекулу ЛПС во внешней мембране), олигосахарида кора, который связан с липидом А через остаток 3-дезокси-D-манно-окт-2-улозоновой кислоты (Kdo, моносахаридный маркер грамотрицательных бактерий) и О-специфического полисахарида (ОПС) [2]. Молекула полностью достроенного ЛПС (S-форма, от англ. «smooth» – гладкий) характерна для большинства встречающихся в природе диких штаммов бактерий, образующих колонии гладкой формы. Потеря в процессе биосинтеза ОПС приводит к появлению шероховатых колоний, и их ЛПС (R-форма, от англ. «rough» – шероховатый) содержит только липид А и олигосахарид кора. На поверхности клеточной стенки гладких штаммов бактерий наряду с молекулами ЛПС S-формы присутствуют и молекулы ЛПС R-формы. Кроме того, часть молекул ЛПС S-формы обладает ОПС, который представлен только одним олигосахаридным фрагментом (SR-форма). Такого рода гетерогенность имеет биологическое значение, так как благодаря именно этому достигается более плотная упаковка молекул ЛПС на клеточной поверхности, обеспечивая защиту бактериальной клетки от проникновения вредных для ее жизнедеятельности веществ [2]. Структура ЛПС, особенно липида А и олигосахарида кора, имеет решающее значение для целостности, гибкости и текучести внешней мембраны, а также для нормальной физиологии и роста микроорганизмов [2].

Многие бактерии (преимущественно с ЛПС в R-форме) могут продуцировать внеклеточные полисахариды. Бактериальные внеклеточные полисахариды обычно встречаются в двух формах: в виде капсульных полисахаридов (КПС), если они связаны (либо слабо связаны) с клеточной поверхностью, и полисахаридов, секретируемых в окружающую среду (экзополисахариды, ЭПС). Присутствие этих биополимеров указывает на их специфические свойства и функции, которые полезны и необходимы для микроорганизмов. Как и молекулы ЛПС, они играют важную роль в защите бактериальной клетки от суровых условий окружающей среды, в поверхностной адгезии (обычно через образование биопленок), межклеточной трансдукции сигнала и в сопротивлении иммунному ответу организму хозяина [3, 4]. С точки зрения состава и структуры, полисахариды грамотрицательных бактерий (ОПС в составе ЛПС, КПС и ЭПС) представляют собой регулярные линейные или разветвленные полимеры, как правило, включающие от двух до восьми моносахаридов в повторяющемся звене. Встречаются полисахариды с моносахаридным повторяющимся звеном (гомополимеры). Длина полисахаридной цепи может варьироваться от 1 повторяющегося звена до 50 и более звеньев. Моносахаридный состав углеводсодержащих биополимеров морских грамотрицательных бактерий чрезвычайно разнообразен. Среди них нейтральные сахара в пиранозной и фуранозной формах (пентозы, гексозы, гептозы и их производные), амино- и диаминосахара, уроновые кислоты (в том числи амино- и диаминоуроновые кислоты), дезокси- и дидезоксисахара, улозоновые кислоты и разветвленные моносахариды, как распространенные в природе, так и не найденные в других источниках. Кроме того, гликополимеры грамотрицательных бактерий часто содержат неуглеводные заместители, такие как ацетильные, метильные, аминоацильные, глицерильные, пирувильные, сукцинильные, лактильные, фосфатные и сульфатные группы [2–4]. Природа, последовательность, аномерная конфигурация и тип замещения индивидуальных моносахаридных остатков внутри повторяющейся единицы является характерным и уникальным для каждого биополимера. В силу разнообразия компонентов и их связей возможно существование беспрецедентно большого количества структур полисахаридных цепей, что находит свое подтверждение в природе [2–7].

Исследование углеводсодержащих биополимеров морских грамотрицательных бактерий имеет и важное практическое значение. Человечество с давних времен стремилось использовать сырьевое богатство Океана, и в настоящее время морские микроорганизмы рассматриваются как источник необычных по химическому строению и свойствам природных соединений, обладающих богатейшим фармацевтическим потенциалом. Огромное разнообразие структурных комбинаций бактериальных полисахаридов обусловливает их уникальные биологические свойства, такие как иммуномодулирующие, противовирусные, противоопухолевые, антиоксидантные, антикоагулянтные и др. Благодаря высокой биологической активности, биоразлагаемости и биосовместимости углеводсодержащие биополимеры морских грамотрицательных бактерий активно исследуются с точки зрения применения в биомедицине, функциональном питании, косметологии и других индустриальных секторах экономики [3, 4].

ЛПС (в частности, липиды А) морских грамотрицательных бактерий, характеризующиеся необычными структурными особенностями, рассматриваются как потенциальные ингибиторы передачи сигналов, опосредованных Толл-подобным рецептором 4 (TLR4). Немногочисленные исследования выявили специфические и необычные химические структуры липидов А морских бактерий, которые характеризуются симметричным распределением жирных кислот (в случае гексаацилированных форм), низкой степенью ацилирования (пента-, тетра- или триацилированные формы) и фосфорилирования, а также содержанием жирных кислот, не характерных для липидов А энтеробактерий (очень короткие и/или ненасыщенные ацильные цепи). Отличительные особенности липидов А нашли отражение в интересном иммунологическом поведении молекул ЛПС морских грамотрицательных бактерий, которое включает очень слабую иммуностимулирующую активность или даже антагонистические свойства [2, 8, 9]. Таким образом, исследование структур углеводсодержащих биополимеров морских бактерий, безусловно, является фундаментальной отправной точкой для понимания молекулярных основ процессов адаптации, но также чрезвычайно важно в перспективе реализации новых терапевтических препаратов направленного действия [4, 8–10].

Первые работы по исследованию ЛПС и КПС морских грамотрицательных бактерий появились в 80-е годы прошлого столетия, и в настоящее время число их неуклонно растет. Основные результаты исследований ЛПС и внеклеточных полисахаридов морских грамотрицательных бактерий представлены в обзорах [2–8]. В настоящем сообщении будут описаны структуры и биологические свойства наиболее интересных, на наш взгляд, ЛПС и КПС из морских грамотрицательных бактерий, выделенных и охарактеризованных в Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Елякова ДВО РАН.

Сульфатированные полисахариды морских грамотрицательных бактерий

Сульфатированные полисахариды уже долгое время являются объектами повышенного внимания и интенсивных исследований. Постоянно растущий интерес к этим полисахаридам объясняется их низкой токсичностью и разнообразной биологической активностью, которая может быть использована при создании медицинских препаратов нового поколения. Как правило, объектами исследований являются сульфатированные полисахариды – компоненты клеточной стенки водорослей (фукоиданы, каррагинаны, ульваны) и гликозаминогликаны беспозвоночных. Перспективными биологически активными веществами могут являться и углеводсодержащие биополимеры морских микроорганизмов. Действительно, морские грамотрицательные бактерии являются богатым источником сульфатированных полисахаридов, не имеющих в природе структурных аналогов.

Род Pseudoalteromonas был образован в 1995 г. на основании ревизии гетерогенного рода Alteromonas и на данный момент включает в себя 49 валидно описанных видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/pseudoalteromonas). Грамотрицательные бактерии рода Pseudoalteromonas представляют собой облигатные морские бактерии, широко распространенные в морской среде и выделяемые из различных морских источников. С точки зрения строения полисахаридов клеточной стенки бактерии рода Pseudoalteromonas являются наиболее изученными среди морских микроорганизмов, и не удивительно, что первый сульфатированный полисахарид, описанный для грамотрицательных бактерий, был выделен из представителя данного рода. Микроорганизм Pseudoalteromonas agarivorans КММ 232 был изолирован из образца воды, отобранной на глубине 500 м в северо-западной части Тихого океана. По своим физиолого-биохимическим и генетическим свойствам данный штамм был первоначально идентифицирован как P. marinoglutinosa. Дальнейшие фенотипические, филогенетические исследования и ДНК-ДНК гибридизация показали, что эта бактерия представляет новый вид рода Pseudoalteromonas, который был описан как P. agarivorans [11]. При культивировании на твердой питательной среде микроорганизм образует два типа колоний: гладкие (S-форма) и шероховатые (R-форма). Отличительной особенностью ОПС P. agarivorans КММ 232 (S-форма) является наличие сульфатной группы, которая, как уже упоминалось, была впервые идентифицирована в составе ОПС грамотрицательных бактерий [12]:

→6)-β-D-Manp-(1→4)-α-L-Rhap2S-(1→

Род Idiomarina в настоящее время насчитывает 14 валидно описанных видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/idiomarina). Микроорганизм Idiomarina abyssalis КММ 227^T был выделен из образца морской воды, отобранной на глубине 4000 м в северо-западной части Тихого океана. Повторяющееся звено полисахарида из микроорганизма I. abyssalis КММ 227^T представляет собой разветвленный пентасахарид и содержит остаток 3-(4-гидроксибутирамидо)-3,6-дидезокси-D-глюкозы, сульфатированный по второму положению (b-D-Qui2S3N(4Hb)) [13]:

→3)-b-D-QuipNAc4NAc-(1→3)-b-D-GlcpNAcA-(1→4)-b-D-GlcpNAcA-1→

4

↑

1

b-D-Quip2S3N(4Hb)-(1→2)-α-L-Rhap

Микроорганизм Marinicella litoralis KMM 3900^T был выделен из образца морской воды, собранной в прибрежной зоне зал. Петра Великого Японского моря. По мнению многих исследователей, условия обитания в пределах морского шельфа (резкие изменения температуры и солености, активное перемешивание, влияние приливных волн и наземных стоков) отличаются от таковых для открытых вод морей и океанов или глубоководной среды. Исследование бактерий, ассоциированных с прибрежной средой обитания, является важным направлением в морской микробиологии. Род Marinicella в настоящее время насчитывает уже 6 валидно описанных видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/marinicella). Микроорганизм Marinicella litoralis KMM 3900^T продуцирует два ЛПС с различными структурными характеристиками ОПС [14]. Основной ОПС построен из дисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из остатков L-рамнозы (L-Rha), замещенной остатком глицерофосфата, и D-маннозы (D-Man), несущей остаток метилфосфата:

→4)-α-L-Rhap2PGro(~40%)-(1→3)-β-D-Manp6PMe(~80%)-(1→

Минорный полисахарид ‒ гомополимер, состоящий из сульфатированных остатков 3-O-метил-D-маннозы:

→2)-α-D-Manp3Me(~85%)4S6Ac-(1→

Гамма-протеобактерии семейства Halomonadaceae включают множество умеренно галофильных и галоалкалофильных видов, принадлежащих к 14 достоверно описанным родам (https://lpsn.dsmz.de/family/halomonadaceae). Типовой род Halomonas в настоящее время является самым крупным в семействе и насчитывает 128 валидно описанных видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/halomonas). В пределах семейства Halomonadaceae только два рода – Halomonas и Cobetia были изучены в отношении структуры углеводсодержащих биополимеров.

Микроорганизм Halomonas halocynthiae KMM 1376^T был изолирован из образца жаберной ткани пурпурной асцидии Halocynthia aurantium. Полисахарид, продуцируемый H. halocynthiae KMM 1376^T, представляет собой сульфатированный маннан, построенный из трисахаридных повторяющихся звеньев и содержащий α-(1→2)- и α-(1→3)-связанные остатки D-маннозы [15]:

→2)-α-D-Manp3,6S-(1→3)-α-D-Manp2Ac6S-(1→3)-α-D-Manp-(1→

Ранее α-(1→2, 1→3)-связанные D-маннаны были описаны для OПС Escherichia coli coli O9, O9a и Klebsiella pneumonia O3 [16]. Сульфатированный по положениям O-4 и O-6 α-(1→3)-связанный D-маннан и частично сульфатированный по положению O-2 β-(1→4)-связанный D-маннан были выделены из красной водоросли Nemalion helminthoides [17] и зеленой водоросли Codium vermilara [18] соответственно. Среди полисахаридов грамотрицательных бактерий сульфатированный маннан был обнаружен впервые.

Бактерии рода Cobetia впервые описаны в 1970 г. и первоначально были отнесены к виду Arthrobacter marinus [19]. В ходе дальнейших исследований их отнесли к различным родам, таким как Pseudomonas, Deleya и Halomonas [20–33]. Затем, основываясь на анализе последовательностей 23S и 16S рРНК и изменениях в описании вида Halomonas marina, включая новые признаки, авторы предложили отнести их к новому роду Cobetia, входящему в семейство Halomonadaceae [24]. В настоящее время род Сobetia включает в себя 5 валидно описанных видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/cobetia).

Два штамма микроорганизма Cobetia pacifica (KMM 3879^T и КММ 3878) и C. litoralis KMM 3880^T были изолированы из образца донного песка, собранного в прибрежных водах Японского моря. Микроорганизм С. pacifica типового штамма KMM 3879^T продуцирует сульфатированный полисахарид, построенный из разветвленных трисахаридных повторяющихся звеньев, и имеет следующую структуру [25]:

→6)-α-D-Glcp2Ac3S-(1→2)-α-L-Rhap-(1→

4

↑

1

β-D-Galp3S

Микроорганизм С. pacifica штамма КММ 3878 также продуцирует сульфатированный полисахарид, представляющий собой галактан, состоящий из линейных трисахаридных повторяющихся звеньев и содержащий остаток пировиноградной кислоты (Pyr) [26]:

→4)-β-D-Galp2,3S-(1→6)-β-D-Galp3,4(S-Pyr)-(1→6)-β-D-Galp-(1→

Микроорганизм C. litoralis KMM 3880^T продуцирует уникальный полисахарид, построенный из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих остаток Kdo, сульфатированный по пятому положению [27]:

→7)-β-Kdoр4Ac5S-(2→4)-β-D-Manр6Ac-(1→

2

↑

1

β-D-Glcp

Морские бактерии рода Cobetia интересны тем, что все изученные штаммы продуцируют сульфатированные полисахариды, что не характерно для большинства грамотрицательных бактерий. Наиболее близким по структуре к полисахариду C. pacifica KMM 3879^T является сульфатированный ЭПС морской бактерии Pseudomonas sp. WAK-1 [28]. Интересно отметить, что ЭПС Pseudomonas sp. WAK-1 проявляет цитотоксическую активность в отношении различных клеточных линий рака центральной нервной системы и легкого, а также индуцирует апоптоз клеток гистиоцитарной лимфомы линии U-937 [29].

КПС С. pacifica КММ 3878 содержит остаток дисульфатированного моносахарида - 2,3-О-дисульфат-D-галактозы (β-D-Galp2,3S), обнаруженного среди бактериальных полисахаридов впервые. КПС имеет близкую структуру с полисахаридом, продуцируемым грамотрицательной бактерией H. aquamarina EG27S8QL, и отличается от него положением одной сульфатной группы [30]:

→4)-β-D-Galp3S-(1→6)-β-D-Galp3,4(S-Pyr)-(1→6)-β-D-Galp3S-(1→

Особенностью ОПС С. litoralis KMM 3880^T является наличие сульфатированного остатка Kdo, встречающегося в бактериальных ЛПС, как правило, в фосфорилированной форме. Идентичный сульфатированный высший моносахарид содержит полисахарид морской альфапротеобактерии Poseidonocella pacifica KMM 9010^T.

Род Poseidonocella на данный момент включает в себя только 2 валидно описанных вида (https://lpsn.dsmz.de/genus/poseidonocella). Полисахарид P. pacifica KMM 9010^T представлен дисахаридным повторяющимся звеном и помимо упомянутой выше сульфатированной улозоновой кислоты включает остаток 2-О-сульфат-D-рамнозы (D-Rha2S) [31]:

→7)-β-Kdoр4Ac5S-(2→3)-β-D-Rhaр2S-(1→

Другой представитель рода Poseidonocella – P. sedimentorum KMM 9023^T продуцирует полисахарид, построенный из дисахаридных повторяющихся звеньев, и содержит остатки 3-дезокси-9-O-метил-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновой кислоты и 2-O-сульфат-D-глюкуроновой кислоты [32]:

→4)-α-Kdnp9Me-(2→4)-α-D-GlcpA2S3Ac-(1→

3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновая кислота, как правило, является компонентом клеточных стенок некоторых актиномицетов (тейхулозоновые кислоты) [33]. Среди грамотрицательных бактерий 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновая кислота была идентифицирована в составе капсульных полисахаридов микроорганизмов K. ozaenae K4 и Ensifer fredii SVQ293 [34, 35].

Важно отметить, что большинство сульфатированных биополимеров из морских грамотрицательных бактерий в разной степени обладают антипролиферативным действием по отношению к различным линиям опухолевых клеток человека. Так, для полисахаридов из H. halocynthiae KMM 1376^T, С. pacifica КММ 3878, C. litoralis KMM 3880^T, P. pacifica KMM 9010^T и P. sedimentorum KMM 9023^T был показан ингибирующий эффект в отношении самопроизвольного образования и роста колоний опухолевыми клетками линий НТ-29, HCT-116, DLD-1 (рак кишечника), MDA-MB-231, MCF-7 (рак груди), SK-MEL-5 и SK-MEL-28 (меланома). Наиболее интересные результаты были получены в результате исследования КПС микроорганизма Kangiella japonica KMM 3897 [36].

Род Kangiella (cемейство Kangiellaceae) в настоящее время насчитывает 10 валидно описанных видов бактерий (https://lpsn.dsmz.de/genus/kangiella). Повторяющееся звено КПС K. japonica KMM 3897 представляет собой линейный трисахарид, состоящий из двух остатков D-GlcNAc, один из которых сульфатирован по 4 и 6 положениям, и 2-амино-2-дезокси-D-маннуроновой кислоты [36]:

→3)-α-D-GlcpNAc4,6S-(1→4)-β-D-ManpNA3Ac-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→

Наличие как отрицательно, так и положительно заряженных моносахаридных остатков придают полисахариду цвиттер-ионные свойства. Гликополимеры с цвиттер-ионной природой также были выделены из бактерий Morganella morganii, Streptococcus pneumoniae PnC, Bacteroides fragilis PSA [37] и I. zobellii [38]. С другой стороны, полисахариды, содержащие в своем составе гексозамины, уроновые кислоты и сульфатные группы, могут имитировать полисахариды, известные как гликозаминогликаны. В результате исследования антипролиферативной активности КПС K. japonica KMM 3897 было установлено, что полисахарид оказывает избирательное действие на клетки протоковой карциномы молочной железы человека линии T-47D [36]. Исследование механизма антипролиферативного действия показало, что полисахарид индуцирует арест клеточного цикла в фазе G0/G1, ингибируя образование активных комплексов CDK4/CDK6/D1 и фосфорилирование белка супрессора опухоли Rb. Кроме того, обработка опухолевых клеток полисахаридом приводила к повреждению митохондрий, сопровождающемуся изменением Δψm и высвобождением апоптотических факторов. Полисахарид вызывал активирование таких маркеров апоптоза, как PARP, каспаза-3 и каспаза-9. Активация проапоптотических белков p53, Bax, цитохрома С, а также ингибирование антиапоптотического белка Bcl-2, свидетельствовало о том, что апоптоз идет по внутреннему (митохондриальному) пути [39].

Капсульные полисахариды морских психротолерантных грамотрицательных бактерий

Криосфера покрывает около одной пятой поверхности Земли. Это системы ледяных облаков, снежный покров, сезонно-мерзлые почвы, многолетние ледяные покровы, наледи, ледники, горные породы с подземными льдами. Вода в данных условиях почти всегда находится в замерзшем или сильно переохлажденном состоянии. Несмотря на это, в таких экстремальных средах обитают микроорганизмы всех трех доменов (прокариоты, археи, эукариоты) [40]. Микроорганизмы, адаптированные к холоду, классифицируются как стенотермные (облигатные, истинные или обязательные психрофилы) или эвритермные (факультативные психрофилы или психротолерантные микроорганизмы) [41]. Одним из типичных представителей таких микробных сообществ, адаптированных к холодным местам обитания, являются бактерии рода Psychrobacter. Бактерии рода Psychrobacter –психротолерантные (некоторые виды психрофильные) и галотолерантные микроорганизмы. Специфические физиологические свойства бактерий рода Psychrobacter способствуют их широкому распространению в природе: их изолируют из морских (вода, донные осадки, рыбы), наземных (домашние птицы, пищевые продукты) источников, а также из клинического материала. Благодаря адаптации к низким температурам окружающей среды психрофильные и психротолерантные бактерии способны обитать в холодных условиях экосистем Мирового океана, о чем свидетельствует обнаружение многих видов рода Psychrobacter. В настоящее время род Psychrobacter насчитывает 44 валидно описанных вида (https://lpsn.dsmz.de/genus/psychrobacter).

Микроорганизм Psychrobacter marincola KMM 277^T был изолирован из гомогенизированных внутренних тканей асцидии Polysyncraton sp. КПС, продуцируемый данным микроорганизмом, представляет собой высокомолекулярный полимер, построенный из разветвленных гексасахаридных повторяющихся звеньев [42]:

→3)-β-D-GlcpNAc -(1→3)-α-D-GalpNAcA-(1→

4

↑

1

β-Psep5(R-Lac)7Ac-(2→2)-α-D-Glcp-(1→3)-β-D-GalpNAcA-(1→2)-β-D-Ribf

Отличительной особенностью данного КПС является присутствие 7-N-ацетиламино-3,5,7,9-тетрадезокси-5-N-[(R)-2-гидроксипропаноиламино]-L-глицеро-L-манно-нон-2-улозоновой кислоты (Pse5(R-Lac)7Ac). Данное производное псевдаминовой кислоты среди бактериальных гликополимеров обнаружено впервые. Важно отметить, что другой представитель рода Psychrobacter – P. arcticus 273-4, продуцирует КПС, содержащий 5,7-ди-N-ацетил-3,5,7,9-тетрадезокси-L-глицеро-L-манно-нон-2-улозоновую кислоту [43]. Кроме того, для микроорганизма P. cryohalolentis K5^T был описан полисахарид с аналогичной архитектурой: повторяющееся звено этого полимера состоит из дисахаридного остова и относительно длинной тетрасахаридной боковой цепи [44]. Данный КПС проявлял выраженное антипролиферативное действие по отношению к клеткам линий Raji (лимфома Беркитта) и HL-60 (промиелоцитарная лейкемия).

Микроорганизм P. submarinus KMM 225^T был изолирован из образца воды, собранной на глубине 300 м. Его КПС содержит два относительно редких производных моносахаридов – 2-ацетамидо-2,4,6-тридеокси-4-[(S)-3-гидроксибутирамидо]-D-глюкозу (D-QuiNAc4N(S-Hb)) и 4,6-O-[(S)-1-карбоксиэтилиден]-2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозу (D-GlcNAc4,6(S-Pyr)) [45]:

→3)-β-D-QuipNAc4N(S-Hb)-(1→2)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→

4

↑

1

β-D-GlcpNAc4,6(S-Pyr)

Среди бактерий рода Psychrobacter остаток D-QuipNAc4N(S-Hb) был обнаружен в полисахариде P. maritimus 3pS [46]. Второе редкое производное – D-GlcpNAc4,6(S-Pyr) ранее было обнаружено в ОПС E. coli O-149, O112ac, Shigella dysenteriae type 2, а также в олигосахариде кора Pseudomonas stutzeri OX1 [47–49]. КПС P. submarinus KMM 225^T незначительно снижал жизнеспособность, но эффективно подавлял образование колоний различных типов раковых клеток, из которых наиболее выраженное ингибирование было показано для клеток хронического миелогенного лейкоза человека K-562 [45].

Среди других бактерий, изолированных из глубоководных мест обитания, интерес представляет микроорганизм Devosia submarina KMM 9415^T. Род Devosia в настоящее время насчитывает 37 валидно описанных видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/devosia). Штамм D. submarina KMM 9415^T был изолирован из образца донных отложений, собранных на глубине 515 м. Структурное исследование компонентов клеточной стенки показало, что данный микроорганизм продуцирует два различных по структуре КПС [50]. Повторяющееся звено основного КПС D. submarina KMM 9415^T представляет собой дисахарид и имеет следующую структуру:

→2)-α-D-Araf-(1→5)-α-D-Araf-(1→

Минорный КПС также построен из дисахаридных повторяющихся звеньев и содержит остаток редкого моносахарида – D-ксилулозы (D-Xlu):

→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Xluf-(1→

Оба полисахарида нейтральны, что не характерно для морских бактерий. Остаток ксилулозы также был обнаружен в составе ОПС E. coli O95, Yersinia enterocolitica 0:10 и в КПС Campylobacter jejuni RM1221 и Lachnoanaerobaculum saburreum T15 [51–54].

Липополисахариды морских грамотрицательных бактерий

Глубоководная среда обитания представляет собой сложную экосистему с огромным разнообразием форм жизни, в том числе значительной долей микроорганизмов. Жизнь в большинстве глубоководных мест обитаний характеризуется экстремальными абиотическими условиями, включающими высокую соленость, низкую температуру, высокое гидростатическое давление, отсутствие солнечного света и низкое содержание питательных веществ [55, 56]. Глубоководные морские бактерии используют различные адаптивные стратегии для выживания и размножения в среде обитания, которая является разрушительной для большинства других микроорганизмов. Способность морских бактерий справляться с экстремальными экологическими стрессами в основном определяется стабильностью их клеточных мембран, которая, как правило, обеспечивается вариациями их липидного состава [57, 58].

Нами была исследована структура ЛОС (ЛПС R-форма) морской грамотрицательной бактерии I. zobellii KMM 231^T, изолированной из пробы морской воды, отобранной на глубине 4000 м в северо-западной части Тихого океана (рис. 1). ЛОС морской глубоководной бактерии I. zobellii KMM 231^T представлен уникальным пентасахаридным скелетом, включающим короткий монофосфорилированный олигосахарид кора с терминальным остатком 5-амино-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновой кислоты (нейраминовая кислота, Neu). Липид А состоит из классического дисахаридного остова, декорированного двумя фосфатными группами и ацилированного двумя i13:0(3-OH), двумя i11:0 (3-OH) в качестве первичных жирных кислот и i11:0 в качестве вторичной ацильной цепи. Остатки Neu ранее были обнаружены в олигосахаридах кора микроорганизмов Campylobacter jejuni и Helicobacter pylori, которые могут выполнять функцию миметиков антигенов Льюиса либо иметь структурное сходство с гликосфинголипидами группы ганглиозидов [59]. Среди морских бактерий терминальный остаток Neu обнаружен в ЛОС микроорганизма Loktanella rosea KMM 6003T [60]. В то время как в случае патогенов присутствие остатка Neu является попыткой уклониться от иммунной системы организма хозяина, его роль в морских микроорганизмах в настоящее время неизвестна.

 

Рис. 1. Структура ЛОС I. zobellii KMM 231^T

 

Считается, что, с одной стороны, короткий, отрицательно заряженный олигосахаридный фрагмент придает молекуле ЛОС способность активно взаимодействовать с двухвалентными катионами, что, в свою очередь, придает жесткость и устойчивость внешней мембране и всей бактериальной клетке. С другой стороны, различные анионные функциональные группы ЛОС могут действовать как буферная система, регулирующая рН на внешней поверхности мембраны и защищающая бактерию от условий повышенной солености. Кроме того, наличие коротких разветвленных ацильных цепей, входящих в состав липидного фрагмента, можно считать прямым следствием необходимости достижения микроорганизмами потребной текучести внешней мембраны, защищающей бактериальную клетку от воздействия низких температур и высокого давления [8]. Вместе эти факты могут объяснить, почему морские бактерии могут выживать в глубоководной среде.

Род Echinicola относится к семейству Cyclobacteriaceae и включает в себя 8 валидно описанных видов бактерий (https://lpsn.dsmz.de/genus/echinicola). Штамм Echinicola vietnamensis KMM 6221^T был изолирован из образца воды, отобранной на ферме по выращиванию мидий во Вьетнаме. Установлено, что повторяющееся звено ОПС, продуцируемого E. vietnamensi КММ 6221^Т, представляет собой тетрасахарид и имеет следующую структуру [61]:

α-Colp

1

↓

2

→4)-β-D-GlcpNAcA-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→

Данный полисахарид содержит редкий среди бактериальных полисахаридов моносахарид - колитоза (Col).

Штамм E. pacifica KMM 6172^T был выделен из серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius, собранного в бух. Троица (зал. Петра Великого, Японское море). Его полисахарид построен из разветвленных пентасахаридных повторяющихся звеньев и содержит два остатка 2,3-диацетамидо-2,3-дидезокси-D-глюкуроновой кислоты (D-GlcNAc3NAcA) [62]:

β-D-GlcpNAc3NAc2AcA-(1→4)-β-D-GlcpNAc3NAcA

1

↓

2

→6)-α-D-Galp-(1→3)-β-L-Rhap-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→

Исследование структур липидов А ЛПС E. vietnamensis КММ 6221^Т и E. pacifica KMM 6172^T (рис. 2) показало, что они представляют собой чрезвычайно гетерогенную смесь монофосфорилированных, три- и тетраацилированных изоформ, несущих дополнительный остаток D-галактуроновой кислоты на глюкозаминовом остове [63].

 

Рис. 2. Структуры липидов А E. vietnamensis КММ 6221^Т и E. pacifica KMM 6172^T

 

Иммуномодулирующие свойства ЛПС из двух штаммов Echinicola были изучены in vitro на модели клеток HEK-Blue^TM hTLR4, которые являются стабильно трансфицированными клетками HEK293 с генами TLR4, MD-2 и CD14 человека. В качестве положительного контроля был выбран ЛПС Salmonella typhimurium SH 2201, содержащий гекса- и гептаацилированный липид A. Оба ЛПС бактерий рода Echinicola индуцировали значительно более низкую активацию NF-κB и секрецию IL-8 по сравнению с клетками, обработанными ЛПС S. typhimurium. Поскольку некоторые ЛПС, выделенные из морских бактерий, демонстрируют потенциал в качестве ингибиторов провоспалительного действия ЛПС патогенных микроорганизмов, была исследована способность ЛПС бактерий рода Echinicola влиять на TLR4-опосредованную передачу сигналов, запускаемую ЛПС S. typhimurium. Для оценки этой способности HEK-Blue^™ hTLR4 клетки предварительно обрабатывали различными концентрациями ЛПС E. pacifica KMM 6172^T и E. vietnamensis KMM 6221^T, а затем стимулировали ЛПС S. typhimurium. Данный эксперимент показал, что оба ЛПС значительно ингибируют TLR4-опосредованную активацию NF-κB и продукцию IL-8, причем ЛПС E.pacifica KMM 6172^T проявляет более сильные антагонистические свойства, чем ЛПС E. vietnamensis KMM 6221^T [63].

Род Cellulophaga в настоящее время насчитывает 7 валидно описанных видов бактерий (https://lpsn.dsmz.de/genus/cellulophaga), для 5 из которых установлена структура ОПС.

Типовой штамм Cellulophaga algicola ACAM 630^T был изолирован с поверхности диатомовых водорослей Melosira, собранных в прибрежной зоне Восточной Антарктики. Его ОПС построен из разветвленных пентасахаридных повторяющихся звеньев [64]:

α-L-Rha

1

↓

3

→4)-α-D-Manp-(1→3)-β-L-Rhap2OAc-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→

2

↑

1

b-D-GlcpA

Повторяющееся звено ОПС бактерии C. baltica NNO 15840^T, выделенной из бурой водоросли, имеет тетрасахаридную структуру и состоит из повсеместно распространенных как среди наземных, так и морских микроорганизмов моносахаридных остатков [65]:

→3)-α-D-GlcpNAc-(1→2)-β-D-Manp-(1→3)-β-D-Manp2OAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→

Оба полисахарида имеют кислый характер за счет присутствия остатков D-GlcA.

ОПС бактерии C. fucicola NNО 15860^T, изолированной из бурой водоросли Fucus serratus, построен из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих наряду с довольно распространенными моносахаридами остаток Pse5Ас7Ас [66]:

→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-Psep-(2→

Структуру, схожую со структурой C. fucicola NN015860^T, имеет ОПС E. coli O136 [67].

Интересным с точки зрения структуры представляется ОПС микроорганизма C. pacifica KMM 3664^T, изолированного из образца воды, собранной в Амурском заливе Японского моря [68]:

α-D-Fucp4NAc

1

↓

4

→3)-β-D-ManpNAcA-(1→4)-β-D-ManpNAcA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→

Все моносахаридные остатки тетрасахаридного повторяющегося звена ОПС этого микроорганизма представлены аминосахарами. Остатки D-ManpNAcA и D-Fucp4NAc являются компонентами общего энтеробактериального антигена [69, 70].

Штамм EМ41^Т C. tyrosinoxydans был выделен из образца морской воды, собранной у восточного побережья о-ва Чеджу (Южная Корея). ОПС C. tyrosinoxydans EМ41^Т построен из разветвленных пентасахаридных повторяющихся звеньев [71]:

→4)-a-L-Fucp-(1→3)-b-D-GlcpNAc-(1→3)-a-L-Rhap-(1→2)-a-L-Rhap-(1→

2

↑

1

b-D-QuipNAc

Данный ОПС не содержит в своем составе кислых моносахаридных остатков, что является нетипичным, как для исследованных на текущий момент полисахаридов бактерий рода Cellulophaga, так и других морских бактерий. Интересно отметить, что идентичный трисахаридный фрагмент →3)-b-D-GlcpNAc-(1→3)-a-L-Rhap-(1→2)-a-L-Rhap-(1→ ранее был обнаружен в составе ОПС некоторых патогенных микроорганизмов (http://csdb.glycoscience.ru/database).

Для трех бактерий, C. algicola ACAM 630^T, C. baltica NNO 15840^T и C. tyrosinoxydans EM41^T, были установлены структуры липида А (рис. 3). Показано, что липиды А C. algicola ACAM 630^T и C. baltica NNO 15840^T представляют собой сложную гетерогенную смесь, из которой превалирующие формы состоят из трисахаридного остова, декорированного одной фосфатной группой и ацилированного двумя 17:0(3-OH), одной 16:0(3-OH), одной 15:0(2-OH) и одной 16:0 жирными кислотами. Липид А C. tyrosinoxydans EM41^T отличается от них одной ацильной цепью, а именно 16:0(3-OH) кислотой в положении 2΄. Исследование иммуностимулирующей активности показало, что ЛПС из штаммов C. baltica NNO 15840^T и C. tyrosinoxydans EM41^T проявляют более низкую активацию TLR4 по сравнению с ЛПС из S. typhimurium, в то время как действие ЛПС из C. algicola ACAM 630^T сравнимо с действием ЛПС S. typhimurium. Данный эффект можно объяснить присутствием в составе ЛПС C. algicola ACAM 630^T минорных дифосфорилированных изоформ липида [72].

 

Рис. 3. Структуры липидов А C. algicola ACAM 630^T, C. baltica NNO 15840^T и C. tyrosinoxydans EM41^T

 

Заключение

Необходимо отметить, что микроорганизмы являются важной составной частью морских экосистем и играют существенную роль в процессах трансформации и минерализации органического материала. Морфологические и физиолого-биохимические признаки и свойства морских микроорганизмов обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, гидростатическое давление, низкие температуры и др. Соответственно, характерной особенностью многих микроорганизмов, обитающих в море, является их гало-, психро-, барофильность и гало-, психро-, баротолерантность.

Существующие в настоящее время данные позволяют утверждать, что углеводсодержащие биополимеры морских грамотрицательных бактерий отличаются большим разнообразием, встречаются как кислые полисахариды, так и нейтральные. Некоторые микроорганизмы способны продуцировать полисахариды с поликатионной или двойственной цвиттер-ионной природой. Подавляющее большинство полисахаридов морских бактерий построены из довольно редко встречающихся в природе компонентов, среди которых производные уроновых, 2-амино-2-дезоксигексуроновых и 2,3-диамино-2,3-дидезоксигексуроновых кислот. Широко представлены и различные N-ацильные производные аминосахаров, кетосахаров и высших моносахаридов. Среди заместителей неуглеводной природы встречаются остатки карбоновых кислот, неорганических кислот, различные аминокислоты и их производные. Кроме того, отмечены полисахариды, состоящие только из повсеместно распространенных моносахаридов, но, как правило, такие полисахариды являются исключением из общей тенденции. Благодаря высокой структурной неоднородности и наличию разнообразных заряженных функциональных групп углеводсодержащие биополимеры морских грамотрицательных бактерий могут действовать как буферная система, способная регулировать рН и солевой баланс на внешней поверхности мембраны, тем самым защищая бактерии от агрессивных условий окружающей среды. С другой стороны, огромное структурное разнообразие, обеспечивающее широкий спектр конформационных возможностей, предполагает наличие у полисахаридов морских грамотрицательных бактерий разноплановой биологической активности.

Благодаря своему экологическому и биохимическому разнообразию морские бактерии считаются хорошими кандидатами для биотехнологического применения. Углеводсодержащие биополимеры морских бактерий выгодно отличаются от полисахаридов растений и водорослей тем, что для них можно создать определенные воспроизводимые контролируемые параметры производства, в результате чего исключается экологическое воздействие и достигается высокое качество конечного продукта. Вместе с тем превращение бактериального гликополимера в биотехнологический продукт требует скоординированных фундаментальных и прикладных исследований с привлечением всего необходимого опыта для перехода от лабораторных условий к рынку биополимеров.

Об авторах

Максим Сергеевич Кокоулин

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: maxchem@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2245-6802

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Россия, Владивосток

Александра Сергеевна Кузьмич

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Email: assavina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5358-5880

научный сотрудник

Россия, Владивосток

Алина Петровна Фильштейн

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Email: alishichka@mail.ru
ORCID iD: 0009-0000-6293-6582

кандидат химических наук, младший научный сотрудник

Россия, Владивосток

Список литературы

Дополнительные файлы