Application of UV spectrophotometry and reversed-phase HPLC to determine the ionization constant of a new biologically active compound

Full Text

Список сокращений

УФ – ультрафиолетовый; ОФ-ВЭЖХ – обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография; 2-АБФПК – 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид.

ВВЕДЕНИЕ

Одним из направлений научных исследований, проводимых в Пермской государственной фармацевтической академии, является синтез и изучение биологической активности производных 2-аминопиррола. Синтезированные под руководством профессора Н.М. Игидова 2-аминопирролкарбоксамиды демонстрируют на опухолевых клетках различного происхождения цитотоксическую активность, превышающую активность препаратов сравнения (паклитаксела и иматиниба) [1].

2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3 карбоксамид (2-АБФПК) является перспективным для дальнейших исследований соединением данного класса, благодаря высокой активности, простой схеме синтеза и очистки. Структура соединения представлена на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Структура 2-АБФПК.

 

Важной физико-химической характеристикой биологически активного соединения является константа ионизации (pKa), определяющая его фармакокинетические свойства и способность связываться с рецепторами [2, 3]. Кроме того, значение pKa имеет большое значение в процессе разработки методов анализа нового соединения, например, при выборе рН элюента в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), условий жидкость-жидкостной экстракции вещества из биологических жидкостей и тканей и т.д. [4].

Следовательно, определение величины pKa – необходимый этап доклинического исследования потенциального лекарственного средства.

Определение константы ионизации проводили с соблюдением требования руководства GLP "Dissociation Constants in Water".

Для определения константы ионизации применяются различные методы: потенциометрия, кондуктометрия, капиллярный электрофорез, спектрофотометрия в УФ- и видимой области спектра, высокоэффективная жидкостная хроматография и т.д. [5]. Одним из наиболее простых и доступных методов определения pKa является потенциометрическое титрование. Однако использование потенциометрии в анализе 2-АБФПК затруднительно ввиду его плохой растворимости.

Ранее проведенные исследования [6] подтвердили влияние рН растворителя на характер УФ-спектра 2-АБФПК, что делает возможным использование УФ-спектрофотометрии для оценки его константы ионизации. В настоящее время для определения pKa биологически активных соединений также активно применяется высокоэффективная жидкостная хроматография [7]. Низкая растворимость в воде и возможное наличие примесей в тестируемых соединениях не являются ограничением для метода ВЭЖХ.

ЦЕЛЬ

Определение константы ионизации биологически активного соединения 2-АБФПК методами УФ-спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования выступала субстанция 2-АБФПК (серия 0922), очищенная путем двукратной перекристаллизации из абсолютного этанола. Содержание 2-АБФПК в субстанции 99,78%.

Спектрофотометрическое определение pKa

Для определения константы ионизации спектрофотометрическим методом использовали методику, разработанную А. Альбертом и Е. Сержентом [8]. Методика основана на измерении спектров равновесной смеси прототропных форм соединения при нескольких значениях pH вблизи предполагаемого значения pKa.

Ультрафиолетовые спектры регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 в области от 200 до 400 нм.

Фосфатный буферный раствор с рН 3,0 на основе калия дигидрофосфата был приготовлен в соответствии с ОФС.1.3.0003.15 «Буферные растворы». Из данного буфера готовили остальные буферные растворы (рН от 1,67 до 12,00 с шагом в 1 единицу) путем добавления 0,1М раствора ортофосфорной кислоты или 0,1М раствора гидроксида натрия до требуемого значения рН. В качестве крайних точек использовали титрованные растворы 0,1М кислоты хлористоводородной и гидроксида натрия, приготовленные согласно ОФС.1.3.0002.15 «Титрованные растворы». Контроль рН-растворов осуществляли на иономере «И-500» (Аквилон).

Для подтверждения того, что в крайних точках вещество полностью ионизировано (для 0,1М NaOH) или не ионизировано (0,1М HCl), регистрировали УФ-спектры 2-АБФПК в 0,01М NaOH и 0,01М HCl, что согласуется с методикой А. Альберта и Е. Сержента [8]. Отклонение в величинах оптической плотности не превышало 1%, что свидетельствует о том, что в крайних точках существует только либо ионизированная, либо неионизированная молекула. Учитывая плохую растворимость 2-АБФПК в воде, готовили исходный метанольный раствор субстанции с концентрацией 100 мкг/мл. Рабочие растворы с концентрацией 10 мкг/мл получали путем разведения исходного раствора соответствующим буферным раствором.

Поскольку ранее для 2-аминопирролкарбоксамидов исследования по определению показателя ионизации не проводились, для предварительной оценки величины pKa был использован метод определения точки «перегиба» на графике зависимости оптической плотности от рН, в ходе которого регистрировались УФ-спектры поглощения 2-АБФПК в широком диапазоне рН (от 1 до 12). Точка перегиба на кривой принималась за приблизительное значение константы ионизации.

Далее для более точного определения константы анализировали УФ-спектры 2-АБФПК в узком интервале значений рН, вблизи которых фиксировалось предварительное значение pKa. Расчет pKa производили по формуле:

 $pKa=pH+lg\frac{Am-Ax}{Ax-Ai}$;

где Am – это оптическая плотность неионизированного соединения, Ax – оптическая плотность соединения в соответствующих буферных растворах (рН от 1,67 до 12,00 с шагом в единицу), Ai – оптическая плотность ионизированного соединения.

Определение pKa методом ВЭЖХ

Определение pKa методом ВЭЖХ основано на различной способности ионизированных и неионизированных форм аналита удерживаться на обращенно-фазном сорбенте в зависимости от рН среды подвижной фазы.

Объектом исследования являлся метанольный раствор 2-АБФПК и нитрата калия (неудерживаемый компонент). Концентрация соединений в растворе составила 100 мкг/мл.

Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе LC-20 Prominence (Shimadzu) с диодноматричным детектором SPD-M20A.

Условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Zorbax Extend-C18 (4,6×150 мм, 3,5 мкм); температура термостата 40ºС; режим элюирования изократический; скорость потока элюента: 1 мл/мин.

В качестве подвижной фазы использовали элюент состава ацетонитрил – фосфатный буфер (35:65). Фосфатные буферные растворы с различными значениями рН готовили аналогично, как для спектрофотометрического определения. Исследования осуществляли в диапазоне рН элюентов от 2 до 11,5, рекомендованном производителем хроматографической колонки.

Коэффициенты удерживания 2-АБФПК рассчитывали по формуле:

 $k\text{'}=\frac{t_R-t_0}{t_0}$;

где t_R – время удерживания 2-АБФПК, t₀ – время удерживания неудерживаемого компонента (KNO₃). По рассчитанным коэффициентам удерживания строили дифференциальную кривую в координатах Δk´ /ΔpH – pH.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Спектрофотометрическое определение

Анализ спектров 2-АБФПК, снятых в диапазоне рН 1-10, показал наличие выраженного максимума поглощения при 250 нм, а также «плеча» при 225 нм. В сильнощелочной среде (рН > 11) наблюдается батохромный сдвиг и появляются максимумы поглощения при 216 и 336 нм (рисунок 2).

 

Рисунок 2. УФ-спектры поглощения 2-АБФПК при разных значениях рН буферных растворов.

 

Для предварительного определения pKa и построения графика зависимости оптической плотности от рН была выбрана длина волны 250 нм, соответствующая максимальному поглощению 2-АБФПК.

Согласно построенному графику (рисунок 3), точка перегиба, определяемая наибольшим изменением оптической плотности исследуемого соединения, располагается в области рН около 8,2.

 

Рисунок 3. Зависимость оптической плотности 2-АБФПК от рН при 250 нм.

 

Используя приблизительное значение pKa, далее определяли точное значение в узком интервале рН от 7,2 до 8,23 с шагом в 0,2. Для этого регистрировали спектры 2-АБФПК в буферных растворах с соответствующим рН (рисунок 4).

 

Рисунок 4. УФ-спектры 2-АБФПК в буферных растворах (рН 7,2–8,23).

 

Оптическая плотность раствора 2-АБФПК при 250 нм при каждом рН использовалась в расчетах точного значения pKa. Результаты определения константы ионизации представлены в таблице 1. Среднее значение pKa 2-АБФПК составило 7,64±0,14.

 

Таблица 1 / Table 1

Результаты определения pKa методом УФ-спектрофотометрии

Results of pKa determination by UV spectrophotometry

pH		Оптическая плотность при 250 нм (n = 3)			pKa	Оптическая плотность в крайних точках
7,2		0,401			7,53	Am (в 0,1M HCl) = 0,47; Ai (в 0,1M NaOH) = 0,369
7,4		0,398			7,79
7,6		0,407			7,82
7,8		0,434			7,52
8,02		0,445			7,54
8,23		0,450			7,62
Метрологические характеристики
n	f	x−	s2	s	P, %	sx−	t(P,f)	Δx−	ε−
6	5	7,64	0,02	0,134	95,0	0,06	2,57	0,14	1,84

Примечание: n – объем выборки; f – число степеней свободы; x− – среднее значение константы ионизации; s² – дисперсия; s – стандартное отклонение; P – доверительная вероятность; sx− – стандартное отклонение среднего результата; t(P,f) – табличное значение критерия Стьюдента; Δx− – полуширина доверительного интервала среднего значения; ε− – относительная погрешность среднего результата.

 

Оценка метрологических характеристик осуществлялась с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2019. Расчет граничных значений доверительного интервала проводился по критерию Стьюдента.

Для оценки воспроизводимости получаемых результатов были проведены дополнительные эксперименты по определению pKa 2-АБФПК методом УФ-спектрофотометрии с привлечением двух химиков. Исследования проводились в разные дни, на разных приборах. Полученные результаты представлены в таблице 2.

 

Таблица 2 / Table 2

Результаты оценки воспроизводимости определения pKa методом УФ-спектрофотометрии

Results of evaluation of repeatability of pKa determination by UV spectrophotometry

Результаты определения pKa 2-АБФПК
№	Химик 1	Химик 2
1	7,53	7,75
2	7,79	7,43
3	7,66	7,86
4	7,52	7,54
5	7,34	7,47
6	7,62	7,91
pKaср	7,58	7,66
SD	0,15	0,21
Fэксп.	1,96
Fтабл.	5,05

 

Рассчитанный критерий Фишера не превышает табличного значения для 6 измерений, что подтверждает воспроизводимость результатов.

С целью подтверждения у 2-АБФПК только одного значения pKa был использован подход [10, 11], основанный на измерении поглощения соединения в буферных растворах с различными значениями рН (1–12) при двух длинах волн (248 и 250 нм). По результатам эксперимента была построена диаграмма поглощения 2-АБФПК (рисунок 5). Кривая диаграммы имеет линейный вид (коэффициент детерминации R2 более 0,99), что свидетельствует о наличии одного равновесия в системе ионизации исследуемого соединения и, следовательно, одного значения pKa.

 

Рисунок 5. Диаграмма поглощения 2-АБФПК в различных буферных растворах (рН 1–12).

 

Хроматографическое определение

Способность удерживаться на сорбенте в хроматографической колонке зависит от полярности аналита. При изменении рН подвижной фазы меняется соотношение ионизированных и неионизированных форм соединения, следовательно, будет изменяться и его фактор удерживания (коэффициент емкости).

Ранее проведенные исследования показали, что оптимальный диапазон значений коэффициента емкости 2-АБФПК наблюдается при содержании ацетонитрила в водно-ацетонитрильных подвижных фазах от 50% до 35% [12]. В эксперименте по определению константы ионизации использовали элюенты с 35% содержанием ацетонитрила для достижения максимального различия времени удерживания исследуемого соединения при разных значениях рН с учетом приемлемой длительности хроматографического анализа.

Растворы 2-АБФПК (100 мкг/мл) хроматографировали в трехкратной повторности для каждого значения рН подвижной фазы в интервале от 2 до 11. Примеры полученных хроматограмм представлены на рисунке 6.

 

Рисунок 6. Хроматограммы 2-АБФПК, полученные при различных рН элюента (а – 2,35; б – 6,90; в – 11,10).

 

Коэффициент емкости для каждого значения pH рассчитывали по среднему значению трех повторных инжекций с использованием нитрата калия в качестве индикатора «мертвого объема» (t0). Результаты расчетов представлены в таблице 3.

 

Таблица 3 / Table 3

Хроматографические параметры 2-АБФПК при различных рН элюентов

Chromatographic parameters of 2-ABPPC at different pH level of eluents

pH	t0 (n = 3)	tR (n = 3)	k´	Δk´/ΔpH
2,33	1,29	10,65	7,26
3,36	1,27	11,53	8,08	0,80
4,66	1,22	12,32	9,1	0,78
5,6	1,21	13,16	9,88	0,83
6,19	1,21	13,67	10,3	0,71
6,9	1,2	14,31	10,93	0,89
7,37	1,19	15,1	11,69	1,62
8,32	1,19	15,99	12,44	0,79
9,4	1,19	18,3	14,38	1,80
10,15	1,21	20,75	16,15	2,36
11,10	1,18	25,04	20,22	4,28

 

По полученным данным была построена дифференциальная кривая (рисунок 7).

 

Рисунок 7. Кривая первой производной для определения pKa.

 

Перегиб дифференциальной кривой в точке с рН 7,4 соответствует значению pKa 2-АБФПК.

ВЫВОДЫ

Определяемый на этапе доклинических исследований показатель константы ионизации (pKa) является важной характеристикой биологически активных соединений. Нами впервые было определено значение pKa нового соединения 2-АБФПК, обладающего цитотоксической активностью, с помощью двух методов: УФ-спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные результаты (7,64 методом УФ-спектрофотометрии и 7,40 методом ОФ-ВЭЖХ) сопоставимы и указывают на наличие у исследуемого соединения свойств слабой кислоты.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Arthur T. Tsecheev

Perm State Pharmaceutical Academy

Author for correspondence.
Email: arthurtse@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5774-9504

a postgraduate student of the Department of Toxicological chemistry

Russian Federation, Perm

Yurii N. Karpenko

Perm State Pharmaceutical Academy; Parma Clinical LLC

Email: arthurtse@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3174-3678

PhD, Associate professor of the Department of Toxicological chemistry

Russian Federation, Perm; Perm

References

Supplementary files