Development and approbation of an analytical method for the quantitative determination of carbon tetrachloride in freons used in the composition of medicines in the form of an aerosol

Full Text

Список сокращений

ТМТД – тетраметилтиурамдисульфид, ЭЗ – электронный захват.

ВВЕДЕНИЕ

Жесткое нормирование любых примесей в лекарственных препаратах и исключение возможности попадания в макроорганизм токсичных примесей – важнейшая задача современного фармацевтического анализа. К сожалению, существующий набор аннотированных методик не позволяет решать ряд определенных специфических задач. Применение фреонов в медицинских аэрозолях сопряжено с вероятностью ингаляционного внесения в организм пациента четыреххлористого углерода – исходного продукта получения ряда пропеллентов. Четыреххлористый углерод – канцероген [1], сильнейший гепатотоксический яд, вызывающий при регулярном попадании в организм человека и животных цирроз печени [2].

Таким образом, крайне важно разработать инструментарий, позволяющий идентифицировать и количественно определить примеси четыреххлористого углерода в соответствующих лекарственных формах. Газожидкостная хроматография остается перспективным методом фармацевтического анализа [3, 4]. Дополнительные преимущества данному физико-химическому методу добавляет детекция электронного захвата [5]. Первичные данные исследований были опубликованы нами ранее [6]. Материал, представленный в настоящей статье, отражает детальное описание и содержит конечные результаты по разработке и апробации аналитического метода количественного определения четыреххлористого углерода во фреонах, использованных в составе лекарственных средств в форме аэрозоля.

ЦЕЛЬ

Разработать и апробировать аналитический метод количественного определения четыреххлористого углерода во фреонах, используемых в составе лекарственных препаратов в форме аэрозоля.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объект. Четыреххлористый углерод (тетра-хлорметан, хладон 10) – СCl₄, М.м. = 153,8, тяжелая, бесцветная, легколетучая жидкость со сладковатым запахом, напоминающим хлороформ. Температура плавления – 22,96 °С, температура кипения – 76,75 °С, относительная плотность при 20° – [d]₄²⁰ 1,595. Плохо растворяется в воде (0,5 г/л), неограниченно смешивается со спиртом, эфиром, бензолом, бензином [2]. Производитель – «Экос-1» (Россия).

Фреон-12 (дифтордихлорметан, хладон -12) – CCl₂F₂, М.м. = 120,9, бесцветный негорючий газ с эфироподобным запахом при высоких концентрациях. Температура плавления – 155,95 °С, температура кипения – 29,74 °С. Растворим в воде (0,286 г/л) и в органических растворителях [7]. Производитель – «Холодпромсервис» (Россия).

Фреон Novek 7100 (метокси-нонафторбутан) – C₄H₉OCH₃, М.м. = 88,1, прозрачная бесцветная жидкость, температура кипения – 61 °С. Производитель – «Платан» (Россия).

Фреон R141b (фтордихлорэтан) – C₂FCl₂H₃, М.м. = 116,9, легкокипящая, прозрачная и бесцветная горючая жидкость, температура кипения – 32 °С [8], температура плавления – 103,5 °С. Производитель – «Русский холод» (Россия).

Севофлуран (1,1,1,3,3,3-гексафтор-2- (фторметокси) пропан) – C₄H₃F₇O, М.м. = 200,1, прозрачная, бесцветная летучая жидкость, температура кипения – 58,5 °С. Производитель – «Химмед» (Россия).

Для проведения испытаний на присутствие и количественное определение четыреххлористого углерода в газах-пропеллентах, применяемых в составе лекарственных препаратов, использован препарат «Сальбутамол-Фармстандарт» (Россия).

Подготовка установки и образца. Измерения проводили на газовом хроматографе Agilent 7890 с детектором ЭЗ. Были использованы капиллярные кварцевые колонки средней полярности (неподвижная фаза 6% цианопропилфенилсилоксан / 94 % диметилполисилоксан): DB-624 Agilent, ZB-624 zebron (G43) и полярная колонка (неподвижная фаза – полиэтиленгликоль): ZB-wax zebron (G16).

Условия хроматографирования. Температура колонки – температура термостата колонки начальная 70 ºС – 1 мин, подъем температуры до 240 ºС, 20 ºС/мин; скорость газа-носителя (азот) – 1,5 мл/мин; скорость поддува детектора по захвату электронов – 35 мл/мин; температура инжектора – + 250 °С; температура детектора (ЭЗ) – + 200 °С; деление потока – 1 : 5; объем пробы – 1,0 мкл.

Анализируемый компонент – четыреххлористый углерод – является веществом летучим, следовательно, определение подобных соединений с указанными физическими свойствами обычно проводится в варианте парофазного инжектирования проб при помощи автосемплера. Поскольку анализируемый компонент является контаминантом газов-пропеллентов, находящихся под давлением в специальных газовых баллончиках, необходимо было оптимизировать способ отбора пробы из указанной тары и способ введения образца в колонку. Для этого нами разработан способ, изложенный ниже.

К баллону, содержащему испытуемый фреон, подсоединяли игольчатый кран (регулятор), соединенный стальной трубкой с внутренним диаметром 1,6 мм с насадкой с припаянным капилляром из нержавеющей стали длиной 25 мм и внутренним диаметром 0,3 мм.

В качестве резиновой прокладки (уплотнителя) использовали септу от блока-испарителя хроматографа GC-14B Shimadzu (кат. № 201-35584).

Насадку с капилляром с помощью силиконовой трубки подсоединяли к шприцу вместимостью 100 мл, открывали игольчатый кран и несколько раз (не менее 7) заполняли шприц испытуемым фреоном. Затем шприц с помощью той же самой силиконовой трубки подсоединяли к дозирующему устройству MGS-4 с дозирующей петлей 0,5 мм и пропускали через дозирующую петлю не менее 25 мл газообразной пробы.

Образцы вводили в хроматографическую колонку, заполняя промежуточный газоплотный шприц вместимостью 100 мл.

При проведении оптимизации условий хроматографического разделения четыреххлористого углерода с фреонами изучали влияние скорости газа-носителя и температурных режимов термостата на их разделение. Подобран градиент хроматографического разделения для оптимизации и ускорения процесса анализа единичного образца.

Поскольку анализируемая система представляет собой смесь компонентов с разной температурой испарения, то для разделения использовали режим программируемых температур. Температура кипения четыреххлористого углерода составляет 77 ºС, поэтому начальную температуру колонки устанавливали при 70 ºС в течение 1 мин. Для интенсификации процесса разделения подъем температуры задавали в режиме 20 ºС/мин. Конечную температуру разделения устанавливали до 240 ºС, руководствуясь температурой кипения определяемых фреонов. Остальные параметры разделения устанавливались в рутинном варианте (указаны выше).

После подготовки установки хроматографировали стандартный раствор, получая не менее 6 хроматограмм, измеряя площади пика четыреххлористого углерода.

Содержание четыреххлористого углерода в фреоне (Х) в ppm рассчитывали по формуле 1:

$X=\frac{S\times a_0\times P}{S_0\times a\times 100}$;    (1)

где: S – площадь пика четыреххлористого углерода на хроматограмме испытуемого раствора; S₀ – средняя площадь пика четыреххлористого углерода на хроматограмме стандартного раствора; а – навеска испытуемого образца, мг; а₀ – навеска стандартного образца четыреххлористого углерода, мг; Р – содержание основного вещества в стандартном образце четыреххлористого углерода, %.

Проверка пригодности хроматографической системы для определения четыреххлористого углерода. Хроматографическая система считалась пригодной, если эффективность хроматографической колонки, рассчитанная для четыреххлористого углерода, на хроматограмме составляла не менее 10 000 теоретических тарелок; разрешение между пиком четыреххлористого углерода и ближайшими пиками на хроматограмме – не менее 2,0; относительное стандартное отклонение площади пика четыреххлористого углерода на хроматограммах стандартного раствора – не более 2,0%; фактор асимметрии пика четыреххлористого углерода – не менее 0,8 и не более 2,0.

Приготовление исходного раствора (образца) для приготовления калибровочных образцов. В предварительно взвешенный на аналитических весах стеклянный флакон вместимостью 100 мл с клапанным устройством помещали 50 мг (точная навеска) четыреххлористого углерода. Клапанную систему сразу запрессовывали на баллоне, баллон охлаждали до температуры – 35 ºС и заполняли фреоном, до прироста массы около 100 г. Концентрация четыреххлористого углерода в исходном растворе составила около 0,05% (м/м) (около 500 ppm).

Приготовление калибровочных образцов четыреххлористого углерода. В 8 предварительно взвешенных флаконов для аэрозольных препаратов вместимостью 60 мл помещали около 0,1 г, 0,4 г, 0,8 г, 1,6 г, 3,2 г, 6,4 г, 12,8 г, 25,6 г исходного раствора четыреххлористого углерода и доводили массу раствора фреоном до 50 г. Концентрацию четыреххлористого углерода в растворах рассчитывали по разнице масс пустого флакона, флакона с исходным раствором четыреххлористого углерода и флакона после введения фреона. Концентрации четыреххлористого углерода в калибровочных образцах близки к значениям 1, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 ppm. В качестве калибровочного образца с концентрацией четыреххлористого углерода около 512 ppm применяют исходный раствор четыреххлористого углерода.

Измерения. Калибровочные образцы вводили в хроматографическую колонку, аналогично испытуемой пробе, заполняя промежуточный газоплотный шприц вместимостью 100 мл.

Приготовление стандартного раствора. В мерную колбу вместимостью 100,0 мл помещали около 20,0 мг (точная навеска) четыреххлористого углерода, доводили объем раствора матричным раствором до метки и перемешивали (концентрация четыреххлористого углерода – около 0,2 мг/мл).

1,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50,0 мл, доводили объем раствора матричным раствором до метки и перемешивали (концентрация четыреххлористого углерода – около 0,004 мг/мл).

1,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, доводили объем раствора матричным раствором до метки и перемешивали (концентрация четыреххлористого углерода – около 0,0004 мг/мл). Раствор использовали свежеприготовленным.

Приготовление испытуемого раствора. Образцы фреонов (Novek 7100, R141b, Севофлуран) смешивали в эквимолярных количествах. Раствор испытуемого образца фреона помещали в виалу для хроматографии объемом 2,0 мл. Раствор использовали свежеприготовленным.

Статистическую обработку полученных данных проводили, учитывая вероятность 95%. Значение критерия Стьюдента выбиралось в соответствии с таблицами. В расчетах использовались следующие формулы 2–5:

$S=\frac{\sqrt{\sum _{}}{(x-\overline{x})}^2}{n}$    (2)

$RSD=\frac{\frac{\sqrt{\sum _{}}{(x-\overline{x})}^2}{n}}{\overline{x}}100\%$     (3)

$∆x=x_{изм}-{х}_{д}$      (4)

$\epsilon =\frac{х-{х}_{д}}{{х}_{д}}100\%$     (5)

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для идентификации и количественного определения четыреххлористого углерода в пропеллентах, используемых в составе готовых лекарственных средств, применяли метод газожидкостной хроматографии с детекцией электронного захвата в режиме программируемых температур, скорость газа-носителя 1,5 мл/мин, скорость поддува детектора по захвату электронов 35 мл/мин, температура инжектора + 250 °С, температура детектора (ЭЗ) +200 °С, деление потока 1 : 5, объем пробы 1,0 мкл.

По результатам предварительных исследований в качестве оптимальной колонки было решено использовать капиллярную кварцевую колонку DB-624 Agilent с параметрами 30 м × 0,32 мм, толщина пленки 1,8 мкм.

Достоверность полученных данных была подтверждена в ходе определения содержания четыреххлористого углерода в модельных смесях и в лекарственном препарате «Сальбутамол-Фармстандарт».

ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения четыреххлористого углерода в составе испытуемых фреонов была изучена его хроматографическая подвижность на трех разных колонках. Все колонки показали надлежащую способность разделения, однако наилучшее разделение четыреххлористого углерода с фреонами обеспечивала колонка DB-624 Agilent, 30 м × 0,32 мм, толщина пленки 1,8 мкм, которую в дальнейшем и использовали.

Условия определения четыреххлористого углерода и пробоподготовка были изложены выше. Для подтверждения отсутствия в стандартном образце пропелленте – фреоне 12 четыреххлористого углерода – получена хроматограмма, на которой должен присутствовать только пик фреона 12 и отсутствовать пики, совпадающие со временем удерживания с четыреххлористым углеродом (рисунок 1).

 

Рисунок 1. Хроматограмма стандартного образца фреона 12.

Figure 1. A chromatogram of the Freon-12 reference sample.

 

На хроматограмме видно, что присутствует один пик со временем удерживания 2,548 мин, принадлежащий фреону 12.

Для демонстрации разделяющей способности используемой хроматографической системы было проведено хроматографическое исследование стандартного образца фреона 12 с добавлением четыреххлористого углерода (рисунок 2).

 

Рисунок 2. Хроматограмма стандартного образца фреона 12 с добавлением четыреххлористого углерода.

Figure 2. A chromatogram of the reference sample of Freon-12 with the addition of carbon tetrachloride.

 

Полученные хроматографические параметры свидетельствуют, что предложенные нами условия хроматографирования позволяют разделять фреон 12 с четыреххлористым углеродом, время удерживания 2,573 мин для фреона 12 и 2,835 мин для четыреххлористого углерода.

Хроматограмма испытуемого образца фреона 12 представлена на рисунке 3.

 

Рисунок 3. Хроматограмма испытуемого образца фреона 12.

Figure 3. Chromatogram of the test sample of Freon-12.

 

Как видно на представленной хроматограмме, в испытуемом образце фреона 12 присутствует примесь четыреххлористого углерода (время удерживания 2,809 мин). Разработанную методику применяли для определения четыреххлористого углерода в тест-препарате «Сальбутамол-Фармстандарт» (Россия). Результаты анализа в рамках данного метода обработаны статистически и приведены в таблице 1.

 

Таблица 1. Результаты статистической обработки определения содержания четыреххлористого углерода в тест-препарате «Сальбутамол-Фармстандарт» (Россия)

Table 1. The statistical results of determining the content of tetrachlormethane in the preparation "Salbutamol-Pharmstandart" (Russia)

X– мг/л	f	S2	S	RSD	P	ΔX	t(P,f)	ε
0,0158	5	7,4×10-8	2,72×10-4	1,72	95	6,9×10-4	2,57	±4,42

 

Как свидетельствуют результаты, приведенные в таблице 1, содержание четыреххлористого углерода в тест-препарате составило 0,0158±0,0007 мг/л. Ошибка единичного эксперимента при доверительной вероятности Р = 95% составила ±4,42%.

ВЫВОДЫ

Обоснована актуальность контроля примесей в пропеллентах, применяемых в таких лекарственных формах, как аэрозоли. Обозначено, что целесообразно применять газожидкостную хроматографию с детекцией электронного захвата в варианте с капиллярной колонкой. В качестве наиболее оптимальных условий выбран режим программируемых температур, скорость газа-носителя составляла 1,5 мл/мин, скорость поддува детектора по захвату электронов 35 мл/мин, температура инжектора +250 °С, температура детектора +200 °С, деление потока 1 : 5, объем пробы 1,0 мкл. Для хроматографического исследования была использована капиллярная кварцевая колонка DB-624 Agilent с параметрами 30 м × 0,32 мм, толщина пленки 1,8 мкм. Достоверность полученных данных подтверждена анализом модельных смесей и лекарственного препарата «Сальбутамол-Фармстандарт» (Россия), в котором идентифицировано присутствие четыреххлористого углерода.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Oleg A. Selyutin

MIREA – Russian Technological University

Author for correspondence.
Email: selutinoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5825-1337

External PhD Student of the Department of Biotechnology and Industrial Pharmacy

Russian Federation, Moscow

Denis O. Shatalov

MIREA – Russian Technological University

Email: shat-05@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4510-1721

PhD, Associate Professor of the Department of Biotechnology and Industrial Pharmacy

Russian Federation, Moscow

Dmitry I. Pisarev

RUDN University

Email: juniper05@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2996-7712

PhD, Associate Professor

Russian Federation, Moscow

Oleg O. Novikov

RUDN University

Email: ole9222@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7038-9803

PhD, Professor, Deputy Director of the RERC "Pharmacy" for Scientific and Educational Work

Russian Federation, Moscow

Elena T. Zhilyakova

Belgorod State National Research University

Email: ezhilyakova@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8685-1601

PhD, Professor, Head of the Department of Pharmaceutical Technology

Russian Federation, Belgorod

Victoriya V. Chichulina

MIREA – Russian Technological University

Email: murzilka991@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2701-3309

Student of the Department of Biotechnology and Industrial Pharmacy

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files