An approach to standardization of licorice herb (Glycyrrhiza glabra L.)

Full Text

Список сокращений

ГЛРС – Государственный реестр лекарственных средств; ЛС – лекарственное средство; ТСХ – тонкослойная хроматография; СО – стандартный образец; ДСК – диазобензолсульфокислота.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время род Солодка (Glycyrrhiza L.) насчитывает более 30 видов [1–4]. Из них фармакопейными растениями являются только солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.) и солодка уральская (Glycyrrhiza uralensis Fish.) [5], которые с 1778 года разрешены в России для использования в медицинской практике [6]. Согласно ГФ РФ XIV издания, применяются корни солодки – ФС.2.5.0040.15 «Солодки корни» [5].

В соответствии с данными Государственного реестра лекарственных средств (ГРЛС) зарегистрировано более 40 ЛС на основе корней солодки [7], которые обладают широким спектром фармакологической активности и применяются в качестве противовоспалительных, отхаркивающих, антигистаминных, иммуномодулирующих, противоязвенных средств [8–11]. Многочисленными исследованиями химического состава корней показано, что одной из ведущих групп БАС являются тритерпеновые сапонины, среди которых доминирует глицирризиновая кислота (рисунок 1) [12, 13].

 

Рисунок 1. Структурная формула глицирризиновой кислоты.

 

Также к основным БАС относят флавоноиды, главным из которых является халкон ликуразид (рисунок 2) [12].

 

Рисунок 2. Структурная формула ликуразида.

 

При промышленной заготовке корней надземная часть солодки не используется, в результате чего образуется значительное количество растительных отходов. Известно, что трава солодки содержит ряд биологически активных веществ, полисахариды, дубильные вещества, флавоноиды, тритерпеноиды, витамины и др. Доминирующим флавоноидом надземной части является пиноцембрин [14, 15], обладающий противовоспалительным, антипролиферативным, антиоксидантным действием и антибактериальной активностью [16].

Пиноцембрин (рисунок 3), выделенный из этанольного экстракта листьев, проявил ингибирующие свойства на жизнеспособность раковых клеток пяти линий HeLa, MCF-7, MDA-MB-231, Caco-2 и PC3 [16].

 

Рисунок 3. Структурная формула пиноцембрина.

 

Пиноцембрин, выделенный методом колоночной хроматографии из листьев солодки голой, показал антиоксидантные свойства [17]. Водно-спиртовой экстракт травы солодки голой обладает бактерицидной активностью выше, чем у амикацина, в отношении Pseudomonas aeruginosa [18]. Флавоноиды из травы солодки голой снижают побочные эффекты при химиотерапии и лучевой терапии [19]. Также была подтверждена противовоспалительная активность экстракта надземной части, в основе которого лежит модуляция NF-kB/MAPK. Противовоспалительный эффект обусловлен наличием пиноцембрина, глабранина и ликофлавона [20].

На основе суммы флавоноидов надземной части солодки разработан препарат «Глацембрин» в виде твердой лекарственной формы – таблеток, который обладает противовоспалительным действием [14]. Описана методика количественного определения суммы флавоноидов травы солодки голой методом прямой спектрофотометрии в пересчете на пиноцембрин [14]. На наш взгляд, данная методика может давать завышенные результаты определения, так как при аналитической длине волны 290 нм вклад в оптическую плотность вносят и другие фенольные соединения. Кроме того, многократная экстракция (3 раза) сырья не всегда является оправданной, так как в этих условиях возрастает вероятность ошибки методики анализа.

ЦЕЛЬ

Усовершенствование подходов к стандартизации травы солодки голой.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом исследования служила трава солодки голой, заготовленная в пгт. Алексеевка Самарской области (2021 г.), Ботаническом саду Самарского университета (2021 г.), с. Татарская Каргала Сакмарского района Оренбургской области (2017 г.), г. Державинске Республики Казахстан (2018 г.), с. Большая Черниговка Большечерниговского района Самарской области (2019 г.), а также промышленный образец сырья корни солодки АО «Красногорсклексредства». Кроме того, использовались стандартные образцы (СО): пиностробин, ликуразид, кверцетин, рутин, лютеолин и глицирам.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляли с использованием хроматографических пластинок «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», капиллярами LactatProfi3000 наносили 0,02 мл водно-спиртовых извлечений. Рядом наносили 0,01 мл растворы СО пиностробина, ликуразида, кверцетина, рутина, лютеолина и глицирама. Определение проводили в системе хлороформ – этанол (4:1). Хроматографическую пластинку помещали в камеру, которую предварительно насыщали в течение 60 минут смесью растворителей и хроматографировали восходящим способом.

Полученную хроматограмму просматривали при дневном свете, в УФ-свете при λ=365 нм и при λ=254 нм с помощью ультрафиолетового облучателя УФО-254/365 (Петролазер, Россия). Детекцию проводили щелочным раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК) и 3% спиртовым раствором алюминия хлорида (AlCl3).

В качестве количественного метода анализа использована дифференциальная спектрофотометрия, проведенная в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» [5]. Спектральные характеристики водно-спиртовых извлечений оценивали на спектрофотометре Specord 40 (Analytik Jena AG, Германия) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование, проведенное методом ТСХ, показало, что на хроматограмме водно-спиртового извлечения травы солодки голой и в спиртовом извлечении вещества из травы солодки голой методом препаративной ТСХ доминирующим компонентом является пиноцембрин (рисунок 4).

 

Рисунок 4. ТСХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения корней и травы солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) в системе растворителей хлороформ – этанол (4:1): А – детекция в видимом свете; B – детекция в УФ-свете при длине волны 365 нм; C – детекция в УФ-свете при длине волны 365 нм после обработки спиртовым раствором хлорида алюминия (AlCl₃); D – детекция после обработки раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК).

Обозначения: 1 – водно-спиртовое извлечение корней солодки голой, полученное на 70% этиловом спирте; 2 – водно-спиртовое извлечение травы солодки голой, полученное на 70% этиловом спирте; 3 – 96% спиртовое извлечение вещества из травы солодки голой, полученное методом препаративной ТСХ; 4 – СО пиностробина; 5 – СО ликуразида; 6 – СО кверцетина; 7 – СО глицирама; 8 – СО рутина; 9 – СО лютеолина.

 

Данный флавоноид при длине волны 365 нм имеет голубую флуоресценцию. Нами предложен вариант подтверждения диагностического флавоноида пиноцембрина травы солодки голой с использованием в методике СО пиностробина. Флавоноиды пиноцембрин (рисунок 3) и пиностробин (рисунок 5) имеют схожие спектральные характеристики и близки по химическому строению [13].

 

Рисунок 5. Структурная формула пиностробина.

 

При последующем проявлении хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокислоты на уровне пятна пиностробина обнаруживается пятно светло-зеленого цвета.

По литературным данным, основным флавоноидом в траве солодки голой является пиноцембрин (рисунок 3) [14], имеющий максимум поглощения в УФ-спектре при длине волны 290±2 нм. По нашему мнению, именно пиноцембрин в целом определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из травы солодки голой (рисунок 6).

 

Рисунок 6. Электронные спектры водно-спиртового извлечения из травы солодки голой: 1 – исходный раствор; 2 – раствор с добавлением алюминия хлорида.

 

Как отмечалось ранее, была рассмотрена возможность использования в качестве СО пиностробин. При изучении электронных спектров растворов пиноцембрина и пиностробина выяснилось, что они имеют одинаковый максимум поглощения при длине волны 290 нм (прямая спектрофотометрия) [21].

Спектральная характеристика комплекса пиностробина с алюминием хлорида в условиях дифференциальной спектрофотометрии в УФ-спектре наблюдается характерный для флаванонов батохромный сдвиг в длинноволновом спектре максимума поглощения в области 310 нм (рисунки 7, 8) [21].

 

Рисунок 7. Электронные спектры спиртовых растворов пиностробина: 1 – исходный раствор; 2 – раствор с добавлением алюминия хлорида.

 

Рисунок 8. Электронный спектр спиртового раствора пиностробина (дифференциальный спектр).

 

При этом определено, что дифференциальная спектрофотомерия по коротковолновому максимуму поглощения водно-спиртового извлечения из травы солодки голой находится при длине волны 310 нм (рисунок 9).

 

Рисунок 9. Электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из травы солодки голой (дифференциальный спектр).

 

В качестве аналитической длины волны 310 нм при использовании СО пиностробина нами осуществляется пересчет содержания суммы флавоноидов на пиноцембрин путем введения в формулу расчета коэффициента. При отсутствии СО пиностробина используется теоретическое значение удельного поглощения пиностробина, установленное нами экспериментально.

В процессе разработки методики количественного определения изучено влияние условий экстракции на выход флавоноидов при получении водно-спиртового извлечения из травы солодки голой. В результате подобраны оптимальные условия извлечения действующих веществ из растительного сырья: экстрагент – 90% этиловый спирт, степень измельчения – 2 мм, соотношение сырье – экстрагент – 1:50, однократная экстракция – 60 мин (таблица 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Влияние условий экстракции на извлечение суммы флавоноидов из водно-спиртового извлечения из травы солодки голой

Influence of extraction conditions on the extraction of the total flavonoid from an aqueous-alcoholic extraction of Glycyrrhiza glabra L. herbs

Концентрация экстрагента – этилового спирта, %	Соотношение сырье – экстрагент	Время экстракции, мин	Степень измельчения сырья, мм	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин и абсолютно сухое сырье, %
50	1:50	60	2	1,46±0,006
60				1,23±0,005
70				1,21±0,031
80				1,86±0,005
90				2,53±0,001
96				1,59±0,007
90	1:50	30	2	2,02±0,008
		45		2,31±0,001
		60		2,86±0,012
		120		2,32±0,010
90	1:30	60	2	2,18±0,009
	1:50			3,48±0,015
	1:100			3,21±0,014
90	1:50	60	1	3,10±0,013
			2	3,41±0,015
			3	2,26±0,011

 

Методика количественного определения суммы флавоноидов в водно-спиртовом извлечении травы солодки голой. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1,0 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в коническую термостойкую колбу (колба Эрленмейера) со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 90% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на лабораторных весах марки «Сарто ГОСМ» (ЛВ 210-А (RuLV-210-A) №23425181; 2008 г; Россия) с точностью до ±0,001. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор готовят следующим способом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор А), перемешивают и оставляют на некоторое время (40 мин) для образования комплекса флавоноидов с алюминием. Затем измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 310 нм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 96%.

Приготовление стандартного раствора (СО) пиностробина для УФ-спектрофотомерии. Около 0,02 г (точная навеска) пиностробина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл спирта этилового 96% при нагревании на водяной бане. Использование спирта этилового 96% позволяет обеспечить наилучшее растворение СО пиностробина. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры, его объем доводят спиртом этиловым 96% до метки (раствор А СО пиностробина). Затем 1 мл раствора А СО пиностробина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б СО пиностробина). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 310 нм.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$x=\frac{D*m_0*50*50*1,05*100}{D_0*m*50*25*\left(100-W\right)}$,

где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D_o – оптическая плотность раствора СО пиностробина; m – масса сырья, г; m_о – масса СО пиноцембрина, г; W – потеря в массе при высушивании в процентах; 1,05 – коэффициент пересчета.

При отсутствии стандартного образца пиноцембрина целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 310 нм – 738.

$x=\frac{D*50*50*100}{m*738*\left(100-W\right)}$,

где D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 738 – удельный показатель поглощения (E) СО пиноцембрина при 310 нм; W – потеря в массе при высушивании в процентах.

Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве солодки голой представлены в таблице 2. Исходя из результатов статистической обработки проведенных опытов, можно сказать о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой с доверительной вероятностью 95% составляет ±0,43%.

 

Таблица 2 / Table 2

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов из водно-спиртового извлечения из травы солодки голой

Metrological characteristics of the method of quantitative determination of the total flavonoids in the Glycyrrhiza glabra L. herbs

n	f	Х−	S	SХ−	P(%)	T(P, t)	∆Х−	E,%
11	10	3,42	0,02203	0,006643	95	2,23	±0,015	±0,43

 

Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов травы солодки голой и пиностробина с алюминием хлоридом. Линейность методики определяли для серии растворов пиностробина (с концентрациями в диапазоне от 0,016 до 0,16 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,9983.

С использованием разработанной методики нами проанализирован ряд образцов травы солодки голой (таблица 3).

 

Таблица 3 / Table 3

Содержание суммы флавоноидов в образцах травы солодки голой

The content of the total flavonoids in the samples of the Glycyrrhiza glabra L. herbs

Характеристика образца сырья	Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (в %) в пересчете на пиноцембрин
Самарская область (Кинельский район, пгт. Алексеевка), август 2021 г.	3,38±0,015
г. Самара, Ботанический сад Самарского университета, август 2021 г.	0,48±0,002
Оренбургская область (Сакмарский район, с. Татарская Каргала), июль 2017 г.	0,39±0,002
Республика Казахстан, г. Державинск, июнь 2018 г.	1,34±0,006
Самарская область (Большечерниговский район, с. Большая Черниговка), август 2019 г.	1,19±0,005

 

Определено, что содержание суммы флавоноидов варьирует от 0,39±0,002% до 3,48±0,015% в пересчете на пиноцембрин в зависимости от места произрастания, культивирования и года сбора растительного сырья.

ВЫВОДЫ

1. Нами научно обосновано использование СО пиностробина для подтверждения диагностически значимого флавоноида – пиноцембрина травы солодки голой для метода ТСХ.
2. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в солодке голой траве методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием СО пиностробина при аналитической длине волны 310 нм. Содержание суммы флавоноидов для травы солодки голой варьирует от 0,39±0,002% до 3,48±0,015% в пересчете на пиноцембрин в зависимости от места произрастания, культивирования и года сбора растительного сырья. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±0,43%.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Olga A. Belova

Samara State Medical University

Email: belova_oa@pranapharm.ru
ORCID iD: 0000-0002-4767-0824

a postgraduate student of the Department of Pharmacognosy with botany and the basics of phytotherapy

Russian Federation, Samara

Vladimir A. Kurkin

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: v.a.kurkin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7513-9352

PhD, Professor, Head of the Department of Pharmacognosy with botany and the basics of phytotherapy

Russian Federation, Samara

Elizaveta A. Smirnova

Samara State Medical University

Email: lisa215847@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9162-0453

a 6th year student of the Institute of Pediatrics

Russian Federation, Samara

Maksim V. Egorov

Samara State Medical University

Email: m.v.egorov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9441-2628

PhD, Associate professor of the Department of Pharmacognosy with botany and the basics of phytotherapy

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files