DEVELOPMENT OF A METHOD FOR DETERMINING SERTRALINE IN THE BLOOD

Full Text

Введение.  Сертралин (торговое название «Золофт») разработан компанией «Pfizer» более 30 лет назад и относится к антидепрессантам, является производным нафтиламина ((1S,4S)-4-(3,4-дихлорфенил)-N-метил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-амин). Препарат ингибирует обратный захват серотонина (5-НТ) в нейронах центральной нервной системы и превосходит в этом отношении амитриптилин в 100–200 раз, флувоксамин в 9 раз, флуоксетин в 5 раз и кломипрамин в 2 раза. В результате увеличивается содержание серотонина в синапсах, с чем связывают антидепрессивный и антитревожный эффект сертралина. При этом сертралин оказывает очень слабое действие на обратный захват норадреналина и дофамина [1].

Сертралин используется для лечения депрессии, панических атак, обсессивно-компульсивного расстройства, посттравматического стрессового расстройства, социального тревожного расстройства (социальной фобии) и тяжелой формы предменструального синдрома (предменструальное дисфорическое расстройство). Золофт может улучшить настроение пациентов, сон, аппетит и уровень энергии, а также способствует восстановлению интереса к повседневной жизни, уменьшает страх, беспокойство, нежелательные мысли и количество приступов паники и желание выполнять повторяющиеся действия (навязчивые действия, такие как мытье рук, счет и проверка), которые мешают повседневной жизни [1, 2].

Несмотря на широкое применение в медицинской практике, возможны серьезные осложнения и летальный исход при совместном приеме препарата с ингибиторами моноаминооксидазы, трициклическими антидепрессантами, различными психоактивными веществами, в том числе алкоголем. Сертралин способен нарушать психические и физические реакции, необходимые для решение таких задач, как управление транспортными средствами и обслуживанием механического оборудования. Так же, не исключены случаи острых и хронических отравлений данным препаратом. Случаи смертельного исхода при передозировке сертралина были зарегистрированы и при монотерапии [3, 4]. Симптомы передозировки: сонливость, желудочно-кишечные нарушения (рвота, тошнота), тахикардия, тремор возбуждение и головокружение, кома. Специфических антидотов сертралина нет. Концентрация сертралина в сыворотке крови пропорциональна принятой дозе препарата. Максимальная концентрация сертралина в крови наблюдается через 4,5-8,4 ч после приема в зависимости от дозы препарата [2-4].

Сертралин подвергается экстенсивному метаболизму при первом прохождении через печень. Основным начальным путем метаболизма сертралина является N-деметилирование. Период полувыведения N-десметилсертралина из плазмы составляет от 62 до 104 ч. Как биохимические, так и фармакологические испытания показали, что N-десметилсертралин значительно менее активен, чем сертралин. Оба вещества подвергаются окислительному дезаминированию и последующему восстановлению, гидроксилированию и конъюгации с глюкуронидом [2].

Целью данного исследования явилась разработка методик изолирования и определения сертралина в биологических жидкостях.

Материалы и методы. Исследование проводили с таблетками «Золофт» («Pfizer», США). Использовали следующее оборудование: жидкостной хроматограф Shimadzu LC-20 Prominence (Япония) с диодно-матричным детектором SPD-M20A, колонка Shim-pack VP-ODS (5 мкм, 150мм * 4,6мм), вакуумная установка для твердофазной экстракции Waters; патроны для твердофазной экстракции Oasis и патроны HLB; разработку методики изолирования из крови проводили с помощью следующих ферментов: папаин  («МедФлорина», Россия); трипсин (ООО «Самсон-Мед», Россия); химотрипсин (ООО «Самсон-Мед», Россия); гиалуронидаза («Лидаза», ООО «Самсон-Мед», Россия). Для иммунохроматографического исследования использовались тест-полоски разных производителей под следующими торговыми названиями: «Будьте уверены», «NarcoCHEC», «ФАКТОР МЕД».

Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на приборе Shimadzu L02157 в следующих условиях: температура колонки 35 °С; объем пробы 20 мкл. Регистрация при длине волны 215 нм. Управление прибором и обработку хроматограмм осуществляли с использованием программы LabSolution. Скорость потока элюента для аналитической колонки 1,4 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и 1% раствора фосфорной кислоты с рН среды 3,46 (25:75).

Готовили испытуемые растворы сертралина по следующей методике: порошок растертых таблеток около 0,050 мг (точная навеска), помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в подвижной фазе, доводя объем раствора тем же растворителем до метки с последующим перемешиванием. 1,0 мл полученного раствора (0,5 мг/мл) помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводя объем раствора подвижной фазой до метки и снова перемешивали.

На хроматограмме отмечали пик со временем удерживания около 1,95 мин (рисунок 1). Определены пригодность хроматографической системы и установлено, что эффективность (N) составляет 4636, фактор асимметрии (T) 1,218. Хроматографическая система является пригодной. Градуировочный график для количественного определения имеет линейную зависимость в диапазоне исследуемых концентраций (10–200 мкг/мл), 0,99 ≤ R ≤1,0. Определялось значение валидационных параметров cходимости (относительное стандартное отклонение RSD%), не превышающее 2%, по показателю прецизионность не превышает 2%, открываемость (Recovery, %) находится в диапазоне 99,5–100,5%, что соответствует критерию приемлемости [2, 5, 6].

 

Рисунок 1. Хроматограматографическое исследование раствора сертралина с концентрацией 0,1 мг/мл методом ВЭЖХ

Figure 1. Chromatogramatographic determination of sertraline solution with a concentration of 0.1 mg / ml by HPLC

 

Изолирование основания сертралина из раствора его соли проводили жидкость-жидкостной экстракцией органическим растворителем по следующей методике: порошок растертых таблеток растворяли в 10 мл воды очищенной, добавляли раствор серной кислоты до pH=3-4 до полного растворения соли сертралина в воде. К раствору прибавляли 0,1М раствором аммиака до pH=10, 11 и 12 (рКа сертралина 9,48) [2, 4] перемешивали, затем помещали в делительную воронку и проводили экстракцию 10 мл растворителя 2 раза.  Для экстракции использовали следующие растворители и их смеси: хлороформ, хлороформ и метанол (1:1); хлороформ и этанол (9:1, 7:3); хлороформ и изопропанол (9:1; 7:3, 3:7, 1:1)  и 2-дихлорэтан, гептан, дихлорметан и пропанол-2 в соотношении 1:1:1:0,5. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом, выпаривали досуха при комнатной температуре.

Получение данных об эффективности методик пробоподготовки крови (прямой жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ), твердофазной экстракции (ТФЭ) и ферментативного гидролиза (ФГ)) для сертралина проводили на обогащенных модельных образцах донорской крови [7, 8]: к 2,5 мл крови добавляли 2,5 мл раствора сертралина с концентрацией 1 мг/мл в фосфатном буфере с рН=7,4 среды, тщательно перемешивали с использованием роторной мешалки (в течение 5 мин возвратно-поступательными движениями со скоростью 44 об/мин). Модельный комплекс инкубировали в течение 1 ч в термостате при 37˚С [8, 9, 10, 11]. Затем сертралина извлекали с использованием следующих методик.

ЖЖЭ хлороформом: к 2,5 мл образца биожидкости добавляли 25% водный раствор аммиака до значений рН=11 и 2,5 мл хлороформа, перемешивали на мультиротаторе MultiBioRS-24, центрифугировали в течение 10 мин, отбирали нижний хлороформный слой, экстракцию повторяли ещё один раз. Хлороформные извлечения объединяли и выпаривали до сухого остатка. Элюат выпаривали досуха, сухой остаток исследователи методом ВЭЖХ.

ТФЭ на патроне марки Oasis HBL: патроны промывали 1 мл 96% метанола и 1 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Через колонку пропускали 1 мл центрифугата мочи или центрифугата крови со скоростью 0,5 мл/мин и проводили элюирование 1 мл раствора аммония гидроксида 5%, второе элюирование  – 1 мл метанола. Следующее элюирование проводили 1 мл 2% раствора кислоты уксусной в метаноле [9].

Образцы крови также гидролизовали протеазами по методике для химотрипсина, химопсина и трипсина: к 5,0 мл крови добавляли 5 мл 0,2% раствора фермента в 0,1 моль/л растворе аммония гидрокарбоната. Смесь аккуратно перемешивали и инкубировали при температуре 37^°С в течение 1 ч [10, 11, 12, 13]. Далее поступали, как описано выше для проведения ЖЖЭ.

ФГ папаином: к 5 мл модельного комплекса добавляли 5 мл раствора папаина (содержание папаина – 0,1 г) в смеси, состоящей из 3 мл раствора ацетатного буфера с рН=4,7, 1 мл 0,002 моль/л раствора трилона Б (для связывания ионов тяжелых металлов, инактивирующих фермент) и 1 мл 0,1% раствора цистеина. Полученные пробы термостатировали при 37^°С в течение 1 ч [11, 12, 13, 14].  Далее поступали, как описано выше для проведения ЖЖЭ.

ФГ гиалуронидазой: к 5 мл биожидкости добавляли 5 мл 0,2% раствора гиалуронидазы, предварительно растворенной в ацетатном буфере с рН=4,7. Пробы термостатировали при 37^°С 1–2 ч. Инкубировали полученный раствор при 37^°С в течение 1 ч. Охлажденные пробы центрифугировали, центрифугат отбирали. Коррекция до рН=9–10 с помощью водного раствора аммиака и экстракция хлороформом, как описано выше [12].

С помощью иммунохроматографических тест-полосок различных производителей проводили исследования мочи лабораторных животных и 1 мг/мл водного раствора сертралина.

Проводили эксперимент на лабораторных животных (морских свинках) для получения образцов биологической жидкости (мочи), содержащей метаболиты сертралина. Пересчитывали минимальную суточную дозу препарата на массу тела животного. Расчётная доза для морских свинок составила 1,7 мг/кг или 1,2 мг в сутки. Из таблетки готовили раствор с концентрацией 1 мг/мл, который в течение 3 суток вводили животному перорально с помощью шприца. На четвертые сутки морских свинок помещали в метаболическую камеру без ограничения воды и пищи на 6 ч с целью сбора мочи. Содержание лабораторных животных в экспериментально-биологической клинике (виварии) центра клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» осуществлялось в соответствии с международной системой правил и требований к лабораториям, которые занимаются изучением воздействия новых химических соединений на окружающую среду и здоровье человека (Good Laboratory Practice, GLP) [15, 16].

Определение состава метаболитов в моче животных проводили на образцах мочи лабораторных животных методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием. Для этого было приготовлено 3 образца: в три пробирки помещали по 2 мл мочи, с помощью 25% раствора аммиака рН доводили до  11 по универсальному индикатору, затем добавляли по 2 мл хлороформа в каждую из пробирок, плотно закрывали и перемешивали на мультиротаторе со скоростью 50 об./мин в течение 5 мин. Затем образцы центрифугировали в течение 10 минут со скоростью 3000 об./мин. После этого, отделяли органический слой и помещали его в чистые сухие флаконы и оставляли упариваться при комнатной температуре. Флаконы с сухим остатком отправляли на исследование метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС) на приборе Agilent Technologies (США) 7890 A/5977 MSD, управление осуществлялось с помощью программы MassHunter GC/MS, обработку полученных данных выполняли в программах Chemstation Data Analysis, AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System), MassHunter Quantitative Analysis (США). Идентификацию пиков проводили в библиотеках NIST MS Search 2.2, Pmw_TOX3.1

Результаты и обсуждение. Случаи отравления препаратами сертралина не являются редкостью, летальная концентрация препарата в печени считается примерно 17 мг/кг. Исследование на сертралин проводят в случаях, когда есть подозрение на нарушение режима приема препарата пациентом, а также для диагностики передозировки [2, 17].

Согласно Приказу Министерства здравоохранения РФ от 18.12.2015 г. № 933н медицинское освидетельствование включает в себя следующие этапы: предварительный осмотр врачом-специалистом; определение в выдыхаемом воздухе наличия алкоголя; определение наличия психоактивных веществ в моче; выявление уровня психоактивных веществ в моче; определение уровня психоактивных веществ в крови [18, 19]. В качестве предварительных испытаний чаще всего применяют иммунохроматографический анализ. Несмотря на явные преимущества данного метода,экономичность, простота и экспрессность применения, у данного метода есть и недостатки, в 10-15 % случаев существует вероятность появления ложноположительных результатов анализа, которые могут являться результатом кросс-реакций между аналитами, возникающие при наличии в моче освидетельствуемого лекарственных препаратов или их метаболитов, которые не относятся к наркотическим и психотропным, но имеют в своей структуре характерный фрагмент, который и вступает во взаимодействие с антителом тест-полоски [19, 20, 21].

При выполнении исследования образцов мочи с иммунохроматографическими с тест-полосками, предназначенных для диагностики употребления производных 1,4-бензодиазепина и синтетических каннабимиметиков («спайсы») видны отчетливые положительные результаты (рисунок 2). Параллельно проводили исследование с 1 мг/мл водным раствором сертралина. С водным раствором перекрестных реакций не наблюдалось. Таким образом, становится очевидно, что перекрестные реакции дают именно метаболиты антидепрессанта.

 

Рисунок 2. Результаты иммунохроматографического исследования биологической жидкости (мочи) морских свинок после приема суточной дозы сертралина

Figure 2. Results of immunochromatographic examination of the biological fluid (urine) of guinea pigs after taking daily dose of sertraline

 

Метаболический состав сестралина устанавливали при исследовании мочи животных методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детекторованием. Результаты этого исследования представлены на рисунке 3. В моче был определен десметилсертралин – мажорный метаболит, который образуется в первую очередь в результате реакции N-деметилирования сертралина, на хроматограмме наблюдается пик со временем удерживания около 12,75 мин и масс-спектром, идентифицированным по библиотеке прибора с совпадением не менее 85%. На хроматограмме отмечается также пик исходного вещества при синтезе сертралина – сертралинимин. В моче так же обнаружен нативный сертралин (пик со временем удерживания около 12,65 мин и масс-спектром, идентифицированным по библиотеке прибора с совпадением не менее 85%). Данный факт противоречит данным литературы, т.к. рад авторов (Д.С. Данилов с соавт.), утверждают, что сертралин в неизменном виде в моче не обнаруживается [2]. Возможно, это связано с особенностями метаболизма морских свинок, однако это требует более детальной проработки.  

 

Рисунок 3. Хроматографическое исследование извлечения из мочи лабораторных животных методом ГХ-МС: а) хроматограмма полученного извлечения; б) масс-спектр серталина; в) масс-спектр десметилсертралина

Figure 3. Chromatographic study of extractingme from the urine of laboratory animals by the GC-MS: a) the chromatogram of the resulting extraction; b) mass spectrum of sertalin; c) mass spectrum of desmethylsertraline

 

Следовательно, из полученных результатов видно, что разработка частных методик изолирования и обнаружения сертралина в биологических объектах позволит исключить получение недостоверных результатов клинической лабораторной диагностики.

Разработка методики жидкость-жидкостной экстракции из водного раствора показала, что оптимальными условиями являются рН=11 и использование в качестве растворителя хлороформа.

Таблица 1 / Table 1

Результаты статистической обработки данных степени экстракции сертралина из обогащенных образцов крови

Results of statistical processing of sertraline extraction degree data from enriched blood samples

Методика изолирования	Метрологические характеристики степени экстракции, %
		S	ε, %	RSD, %
ЖЖЭ (хлороформ, рН=11)	15,44 + 0,5	0,07	2,93	0,46
ТФЭ	12,48 + 0,3	0,1	1,25	0,51
ФГ (гиалуронидаза)	20,69 +0,11	0,16	3,48	0,76
ФГ (папаин)	17,12 +0,03	0,05	0,70	0,26
ФГ (трипсин)	23,80 +0,03	0,05	3,46	0,19
ФГ (химотрипсин)	18,27 +0,5	0,48	1,53	2,62

 

Из данных литературы известно, что степень связывания сертралина с транспортным белком крови, альбумином, может составлять до 98% [2], следовательно, полученные нами результаты прямой ЖЖЭ с учетом индивидуальных особенностей образцов крови, сопоставимы с данными литературы. В результате проведения ферментативного гидролиза установлено, что данным методика пробоподготовки способствует увеличению степени экстракции сертралина из крови 1,5 раза, при этом наилучший результат демонстрирует фермент трипсин. Эти результаты согласуются с данными проведенных нами ранее исследованиях: трипсин показал высокую эффективность при изолировании производных барбитуровой кислоты из крови [7]. Следовательно, его можно отнести к селективным ферментам для проведения пробоподготовки крови на сертралин.

Методика ТФЭ на патронах HLB показала крайте низкую эффективность даже при экстракции из водного раствора по стандартной методике [9]. Степень экстракции составила не более 25%. Данные результаты ещё раз показывают, что данный метод нельзя отнести универсальным и не следует применять при выполнении скрининговых исследований.

Выводы.

Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что антидепрессант Сертралин (торговое название «Золофт») способен в моче освидетельствуемых лиц давать перекрестные реакции при проведении исследования с иммунохроматографическими тест-полосками на производные 1,4-бензодиазепина и синтетические каннабимиметики («спайсы»).  

Применение методики ферментативного гидролиза крови трипсином позволяет увеличить степень экстракции в 1,5 раза по сравнению с жидкость-жидкостной экстракцией хлороформом и в 2 раза по сравнению с твердофазной экстракцией.

Разработана методика определения серталина методом ВЭЖХ.

About the authors

Anastasia S. Zhuravleva

Email: zhuravleva.anastasiya@pharminnotech.com
ORCID iD: 0000-0003-4672-3477

Polina S. Vikman

St. Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Author for correspondence.
Email: vikman.polina@pharminnotech.com
ORCID iD: 0000-0002-5446-8464
Russian Federation

Evgeniya A. Gritsyuk

Email: evgeniya.gricyuk@spcpu.ru
ORCID iD: 0000-0002-5533-6885

Olga Y. Strelova

Email: olga.strelova@pharminnotech.com
ORCID iD: 0000-0001-6737-1023

Natalia A. Chuvina

Email: chuvina82@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5512-7648

References

Supplementary files