ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОРМЫ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ПЛОДАХ РАСТЕНИЙ РОДА FILIPENDULA

Аннотация

Методом электрофореза в полиакриламидном геле проведено исследование фракционного состава белков и установлен состав молекулярных форм малатдегидрогеназ свежего и высушенного лекарственного растительного сырья, плодов лабазника вязолистного и шестилепестного в условиях повышенной влажности.

Полный текст

К растениям, из которых созданы лекарственные препараты (ЛП), относятся лабазник вязолистный и шестилепестный. При изготовлении ЛП используются различные органы растений указанных видов. Однако препараты на основе плодов лабазника в настоящее время на фармацевтическом рынке Российской Федерации отсутствуют [2]. В связи с этим представляет научный интерес исследование плодов этого растения, и становится актуальным решение вопросов стандартизации лекарственного сырья и препаратов на его основе. К примеру, в процессе высушивания лекарственного растительного сырья белки, содержащиеся в нём, теряют гидратную оболочку, при этом нарушаются четвертичная, третичная структура молекулы и биологическая активность. При формировании оптимальных значений температуры, рН и влажности происходит ренатурация белка с восстановлением первоначальной конформации и каталитической функции энзима. Это приводит к снижению количества действующих веществ и терапевтического действия препарата. В связи с этим очевидна актуальность исследования биохимических характеристик ЛРС, в частности, изучение состава и динамики молекулярных форм (МФ) малатдегидрогеназы (МДГ) [1, 2]. Цель: исследование фракционного состава белков и молекулярных форм малатдегидрогеназы в плодах двух видов лабазника (вязолистного и шестилепестного) в условиях повышенной влажности. Материалы и методы исследования Материалом исследования служили плоды лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного, заготовленные в фазу плодоношения в 2015 году в Самарской и Ульяновской областях. Электрофоретический анализ проводили в камере для электрофореза в плоских блоках полиакриламидного геля с циркуляционной системой охлаждения. Определение проводили с использованием свежего ЛРС, а также сухого ЛРС после экспозиции во влажных условиях в течение 24, 72 и 120 часов при температуре 200С. Для установления фракционного состава неферментных белков клеток растений гелевые пластинки после электрофореза погружали в 1%-ый раствор амидо-черного в 7 %-ой кислоте уксусной на 10 мин. Для определения МДГ использовалась оптимизированная инкубационная среда: водный раствор NAD (1 мг/мл) - 40 мл, нитросиний тетразолиевый (1 мг/мл) - 30 мл, 1 М раствор малата натрия (рН=7,0) - 10 мл, феназинметасульфат (1 мг/мл) - 4 мл, 0,2 М трис-HCl буферный раствор (рН =7,1) - до 100 мл. Гелевые пластины инкубировали 12 часов при 37°С. Определение относительной электрофоретической подвижности белковых фракций проводили с помощью компьютерной программы TLC Manager v.3.12. Результаты исследования и их обсуждение В результате электрофоретического анализа извлечения из свежих плодов лабазника шестилепестного выявлено наличие высокомолекулярных неферментативных белков с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП), равной 0,25, и неферментативных низкомолекулярных белков с ОЭП 0,90. В ходе эксперимента с высушенным лекарственным растительным сырьем, экспозиционированным во влажной среде при комнатной температуре, были установлены следующие закономерности для плодов лабазника шестилепестного: через 24 часа выявляются высокомолекулярные белки с ОЭП 0,19 и неферментативные низкомолекулярные белки с ОЭП 0,75. Фракция с ОЭП 0,75 обнаруживается также через 72 часа и 120 часов. Фракция с ОЭП 0,20 обнаруживается через 120 часов (рис. 1). В извлечениях из свежих плодов лабазника вязолистного нами были выявлены высокомолекулярные неферментативные белки с ОЭП 0,24 и неферментативные низкомолекулярные белки с ОЭП 0,80. В ходе эксперимента с высушенным лекарственным растительным сырьем, экспозиционированным во влажной среде при комнатной температуре, были установлены следующие закономерности для плодов лабазника вязолистного: через 24 часа выявляются неферментативные низкомолекулярные белки с ОЭП 0,57 и ОЭП 0,85. Фракция с ОЭП 0,75 обнаруживается также через 72 часа и 120 часов (рис. 2). Результаты относительной электрофоретической подвижности извлечений из плодов лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного представлены в таблице 1. Проведенный нами электрофоретический анализ молекулярных форм малатдегидрогеназы, основанный на способности заряженных молекул фермента перемещаться в электрическом поле, позволил обнаружить в свежих плодах лабазника шестилепестного две молекулярные формы этого фермента - МДГ-1 и МДГ-3 (табл. 2). МДГ-3 в плодах лабазника вязолистного активна в свежем сырье и в воздушно-сухом сырье, после предварительной инкубации его в течение 3-х суток во влажной среде (рис. 3). При инкубации воздушно-сухого сырья во влажной среде менее и более трёх суток МДГ-3 не определяется, активна МДГ-1. В плодах лабазника вязолистного наибольшую активность проявляет МДГ-3 как в свежем сырье, так и при инкубации сырья 24 и 72 часа. Через 5 суток свою активность проявляет МДГ-1. В плодах лабазника шестилепестного проявляют свою активность МДГ-1 и МДГ-3. В свежем сырье, а также при инкубации высушенного сырья в течение 72 часов активна МДГ-3 (рис. 4). Полосы МДГ-1 наблюдаются лишь в высушенном сырье плодов при инкубации сырья в течение 24 часов и 120 часов. Заключение В плодах лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного выявлено наличие высокомолекулярных и низкомолекулярных неферментативных белковых фракций. Изменение числа фракций неферментативных белков в растениях семейства Filipendula в условиях повышенной влажности отличается специфичностью для каждого растения и является показателем качества лекарственного растительного сырья. В плодах лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного выявлены две молекулярные формы фермента малатдегидрогеназы - МДГ-1 и МДГ-3. Динамика активности молекулярных форм малатдегидрогеназы в вышеуказанных растениях в условиях повышенной влажности носит индивидуальный характер и может быть использована как критерий подлинности и качества ЛРС. Показано, что сушку данного лекарственного растительного сырья следует проводить при оптимально повышенной температуре для ингибирования ферментов и сохранения действующих веществ. Получено экспериментальное подтверждение необходимости хранения лекарственного растительного сырья в сухих и прохладных помещениях.