Различные методы количественного определения верапамила в крови

Полный текст

Введение

Верапамил (α-[3-([2-(3,4-диметоксифенил)-этил]метиламино)пропил]-3,4-диметокси-α-(1-метилэтил)бензолацетонитрил) является лекарственным препаратом группы блокаторов кальциевых каналов, имеющим токсикологическое значение [1]. При диагностике острых отравлений и в судебно-химической экспертизе для количественного определения верапамила используют ряд хроматографических методов, в том числе с масс-спектрометрическим детектированием, а также спектрофотомерию в УФ-диапазоне [2–4]. К используемым аналитическим методам определения верапамила в плазме крови предъявляются требования высокой чувствительности, селективности и соответствия рабочих диапазонов методик уровням терапевтической и токсической концентраций анализируемого вещества в плазме крови.

Цель исследования — сравнительная характеристика аналитических возможностей различных методов количественного определения верапамила в крови, используемых в химико-токсикологическом анализе и судебно-химической экспертизе.

Материалы и методы

В работе использовали стандартный образец верапамила (в форме гидрохлорида) (LGC Standards, Великобритания). Модельные образцы крови готовили путем добавления расчетного количества стандартного образца (в виде метанольного раствора концентрации 10,0 мкг/мл в пересчете на основание) к образцам крови, не содержащим наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ. Диапазон концентраций верапамила в пробах крови составлял 100,0–5000,0 нг/мл (для тонкослойной хроматографии (ТСХ) с компьютерной денситометрией) и 5,0–150,0 мкг/мл (для УФ-спектрофотометрии).

Пробоподготовку образцов крови осуществляли жидкость-жидкостной экстракцией. Объем пробы крови составлял 10 мл. Условия экстракции: хлороформ при рН 9–11; полученные экстракты упаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяли в 50 мкл смеси хлороформ – этанол (1 : 1). При исследовании методом УФ-спектрофотометрии при жидкость-жидкостной экстракции увеличивали объем пробы крови до 50 мл, далее из аликвоты полученного хлороформного экстракта объемом 20 мл проводили реэкстракцию раствором кислоты хлористоводородной концентрации 0,1 моль/л.

Для идентификации верапамила в пробах крови использовали метод хромато-масс-спектрометрии. Исследование осуществляли на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890 с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973N с использованием кварцевой капиллярной колонки HP5-MS (5 % фенилдиметилсилоксан) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования температуры колонки: начальная температура 170 °С (выдержка в течение 1 мин), повышение температуры со скоростью 15 °С/мин до 280 °С с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость газа-носителя — 1 мл/мин в режиме постоянного потока. Температура инжектора — 280 °С, температура аналитического интерфейса — 285 °С. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме без деления потока со сбросом избытка через 1 мин в отношении потоков 1 : 15 (split/splitless); объем пробы — 1 мкл. Анализ исследуемых образцов проводили в режиме сканирования в диапазоне масс 39–550 а. е. м.

Условия анализа методом ТСХ: пробу объемом 50 мкл наносили микрошприцем на пластины для ТСХ «Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ» размером 10 × 15 см в виде полосы толщиной не более 1 мм и шириной не более 0,5 см, при нанесении зону первичной адсорбции высушивалии теплым воздухом. В качестве систем растворителей (подвижных фаз) использовали смеси этилацетат – метанол – аммиак 25 % (17 : 2 : 1), а также метанол – аммиак 25 % (100 : 1,5). Насыщение камеры парами растворителей проводили в течение 30 мин. Детектирование хроматограмм — обработкой реактивом Драгендорфа, а также в УФ-свете при длине волны 254 нм.

При денситометрическом определении полученные хроматограммы фиксировали путем сканирования с оптическим разрешением 900 dpi в True Color режиме на планшетном сканере, сохраняли в виде файлов с расширением jpeg и обрабатывали с использованием программы «ТСХ-менеджер 4.0» [5].

При спектрофотометрическом определении верапамила исследовали реэкстракт из хлороформного извлечения, полученный раствором кислоты хлористоводородной концентрации 0,1 моль/л. Регистрировали спектр поглощения полученного реэкстракта в интервале длин волн 200–400 нм. Условия измерения: регистрирующий спектрофотометр СФ-56; шаг измерения — 1 нм; толщина рабочего слоя — 1 см; раствор сравнения — реэкстракт из «холостой» пробы крови, полученный в аналогичных условиях пробоподготовки.

Определение пределов обнаружения и количественного определения, диапазона определяемых концентраций, правильности и прецизионности проводили в соответствии с рекомендациями «Руководства по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала» [6].

Результаты и обсуждение

Определение верапамила в образцах крови включало два этапа: хромато-масс-спектрометрический скрининг (в режиме полного ионного тока) и последующее количественное определение методами с более низким уровнем селективности — ТСХ с компьютерной денситометрией или УФ-спектрофотометрией. Применение вышеуказанных методов позволяет уменьшить нагрузку на хромато-масс-спектрометрическое оборудование, а также снизить временные и экономические затраты на данное исследование.

При хромато-масс-спектрометрическом скрининге на хроматограммах образцов крови обнаруживался пик неметаболизированного верапамила (рис. 1).

Рис. 1. Хроматограмма образца крови с содержанием верапамила 300,0 нг/мл

Fig. 1. Chromatogram of the whole blood sample with Verapamil concentration of 300,0 ng/ml

Масс-спектр, соответствующий данному хроматографическому пику, позволял идентифицировать анализируемое вещество с вероятностью не менее 80 %, самым интенсивным ионом в масс-спектре является ион с массой 303 а. е. м. (рис. 2).

Рис. 2. Масс-спектр верапамила, выделенного из образца крови

Fig. 2. Mass-spectrum of Verapamil, isolated from the whole blood sample

Для анализа верапамила методом ТСХ были использованы подвижные фазы и вариант детектирования на пластинке, наиболее часто используемые в практике судебно-химической экспертизы (табл. 1).

Таблица 1 / Table 1

Параметры методики идентификации верапамила в крови методом тонкослойной хроматографии

Parameters for the identification of Verapamil content in whole blood by means of thin-layer chromatography method

Для определения предела обнаружения верапамила были проанализированы модельные образцы крови в диапазоне концентраций 100,0–5000,0 нг/мл.

Для пробоподготовки использовали образцы крови объемом 10 мл, а объем пробы, наносимой на хроматографическую пластину, составлял 50 мкл. При определении величины предела обнаружения использовали визуальную регистрацию обработанного изображения хроматограммы, для обработки изображения применяли программные средства «ТСХ-менеджер 4.0». Предел обнаружения верапамила в образцах крови — 150,0 нг/мл (1,0 мкг в пробе).

Влияние балластных веществ крови на результаты анализа учитывали путем исследования «холостых» проб крови в вышеуказанных условиях. При этом на пластинках в диапазоне значений R_f 0,2–0,8 хроматографических зон не детектировали.

Определение характера зависимости аналитического сигнала — площади хроматографической зоны (S) от концентрации определяемого вещества (С) — показало, что при количестве верапамила свыше 5,0 мкг в пробе наблюдается отклонение от линейной зависимости.

Для изучаемого лекарственного вещества была рассчитана градуировочная зависимость, которая описывается уравнением полиномиальной (квадратичной) регрессии: S = 0,081 · C² + 36,2 · X – 501,3. Предел количественного определения составил 300,0 нг/мл, диапазон концентраций в крови, в которых возможно проводить количественное определение (рабочий диапазон методики) — 300,0–5000,0 нг/мл.

При спектрофотометрическом анализе выраженные максимумы в спектре поглощения регистрировали для экстракта с концентрацией верапамила 5,0 мкг/мл, в качестве аналитической использовали длину волны 277 нм (рис. 3).

Рис. 3. Спектр поглощения экстракта из образцов крови (содержание верапамила 5,0 мкг/мл)

Fig. 3. Absorbance spectrum of the whole blood extract (Verapamil concentration was 5,0 mkg/ml)

Был экспериментально установлен линейный диапазон зависимости оптической плотности (D) от концентрации (С), который составил 10,0–160,0 мкг/мл — для фотометрируемых растворов верапамила, полученных из стандартного образца. Уравнение градуировочного графика имеет вид: D = 0,0090 · С + 0,072; величина коэффициента корреляции r составила 0,998.

При исследовании образцов крови предел количественного определения спектрофотометрическим методом составил 6,0 мкг/мл (6000,0 нг/мл), линейный диапазон — 6,0–100,0 мкг/мл (6000,0–100 000,0 нг/мл).

Для оценки правильности и прецизионности (сходимости) методик анализировали образцы крови с известными количествами верапамила трех уровней концентраций в пределах рабочих диапазонов каждой методики. Определяли сходимость результатов измерений (относительное стандартное отклонение), полученных в пяти разных аналитических циклах — между сериями параллельных определений в разные дни (табл. 2).

Таблица 2 / Table 2

Результаты оценки правильности и прецизионности количественного определения верапамила в крови методами тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией и УФ-спектрофотометрии

The evaluation of accuracy and precision of Verapamil quantification method in whole blood by thin-layer chromatography with the use of videodensitometry and UV-spectrophotometry

Относительные погрешности определения верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией, используемые для оценки правильности методики, для всех уровней концентраций не превышали значения ±20,0 %. Для спектрофотометрического метода оценка правильности производилась в области более высоких концентраций и погрешность для среднего и высокого уровня составляет соответственно 22,7 и 27,5 %.

Для спектрофотометрического метода анализа отмечается завышение содержания верапамила в образцах крови, связанное с неконтролируемым вкладом поглощения балластных веществ пептидной природы в оптическую плотность при длине волны 277 нм.

Сходимость результатов определений верапамила методом спектрофотометрии на всех уровнях концентраций не превышала 7,4 %. При анализе верапамила методом ТСХ с компьютерной денситометрией разброс результатов уменьшался от 24,3 % для нижнего уровня концентраций до 5,8 % — для верхнего уровня.

Диапазоны определяемых концентраций верапамила в крови при расчете методом ТСХ с компьютерной денситометрией соответствуют уровням токсической и летальной концентраций. Спектрофотометрическая методика позволяет определять верапамил только при летальных отравлениях, связанных с содержанием неметаболизированного верапамила в крови более 6,0 мкг/мл.

Заключение

В условиях модельного эксперимента дана сравнительная характеристика аналитических возможностей методов ТСХ с компьютерной денситометрией и УФ-спектрофотометрии для определения верапамила в крови. Применение денситометрии для обработки хроматограмм в методе ТСХ позволило количественно определять содержание верапамила в пробах крови на более низком уровне концентраций по сравнению с дипазоном определямых концентраций метода УФ-спектрофотометрии. Достоверность идентификации верапамила в образцах крови при использовании обеих методик обеспечивает хромато-масс-спектрометрический скрининг.

Спектрофотометрическая методика позволяет определять верапамил в крови только на уровне летальных концентраций, показатели правильности превышают ±20,0 %. Определение верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией характеризуется показателями правильности и прецизионности, не превышающими значения ±24,0 %, и может быть рекомендовано для применения в судебно-химической экспертизе и экспресс-диагностике острых отравлений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Александр Васильевич Воронин

Автор, ответственный за переписку.
Email: dimmu2000@mail.ru

кандидат фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Хроматограмма образца крови с содержанием верапамила 300,0 нг/мл

Скачать (206KB)

Метаданные

3. Рис. 2. Масс-спектр верапамила, выделенного из образца крови

Скачать (108KB)

Метаданные

4. Рис. 3. Спектр поглощения экстракта из образцов крови (содержание верапамила 5,0 мкг/мл)

Скачать (70KB)

Метаданные