Pre-treatment of granular osteoplastic material for improving the reparative regeneration of jaw bone defects

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Для устранения костных дефектов челюстей (КДЧ) применяются костнопластические материалы. Считается, что «золотым стандартом» регенерации кости при критических размерах дефекта являются аутологичные костные трансплантаты [1, 2]. В то же время часто наблюдаются осложнения донорских участков [3]. Преодолеть недостатки аутологичных трансплантатов позволяет применение гранулированных костнопластических материалов (ГКМ) [4].

Основными требованиями, предъявляемыми к ГКМ, являются следующие: биосовместимость; контролируемая биоразлагаемость со скоростью элиминации, соответствующей темпу формирования новой костной ткани в месте дефекта; обеспечение трехмерной стабильности реконструкции; отсутствие цитотоксичности; способность инициировать процессы регенерации костной ткани [5].

ГКМ дают предсказуемые результаты лечения в процедурах направленной костной регенерации (НКР), поскольку обладают явными физическими преимуществами [6]. Их высокопористая структура с сообщающейся системой пор, макропоры, сквозные каналы, геометрия пор и топографические характеристики влияют на биологические свойства, такие как клеточная адгезия и пролиферация, а также остеогенная дифференцировка стволовых клеток и клеток-предшественников. Развитая система пор позволяет создать условия для поддержания пролиферации и дифференцировки клеток, обеспечивая возможность газообмена и циркуляции жидкостей [7].

Локальная геометрия поверхностей и трехмерная архитектура гранул ГКМ создают биологическую среду, которая по сравнению с плоскими поверхностями влияет на генетическую экспрессию и форму клеток, мигрирующих на имплантированный биоматериал, оказывает влияние на пространственно-временную организацию клеток и тканей [8, 9]. Искривление поверхности пористых материалов, асимметрия и наличие вогнутостей на их поверхностях повышают клеточную адгезию и выживание [10, 11].

ГКМ не только должны стимулировать остеобласты, рекрутировать их, но и участвовать в их механическом кондиционировании [7]. Однако при производстве ГКМ образуется мелкодисперсная пыль, которая покрывает поверхности гранул, включая поверхности пор и устья каналов. Мелкодисперсная пыль изменяет геометрию пор и герметизирует отверстия каналов. В каналах образуются препятствия из пыли и воздушных пробок. Блокирование пространств каналов воздушными пробками и пылью уменьшает площадь доступных поверхностей ГКМ, препятствует соединению пор в единую дренажную систему и снижает адсорбционную емкость ГКМ, поэтому необходимо определить условия повышения дренажных возможностей ГКМ.

ЦЕЛЬ

Разработать метод подготовки ГКМ перед использованием в клинических условиях для оптимизации качества репаративной регенерации КДЧ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа с исходным материалом и клеточными культурами проходила в культуральном боксе в помещении класса С в стерильных условиях ламинаров (класс А) в центре «БиоТех» СамГМУ. Ростовые среды в процессе культивирования клеток регулярно контролировали на стерильность, контаминацию микоплазмами и вирусами, наличие грибковой флоры. Протокол исследования был одобрен комитетом по биоэтике при Самарском государственном медицинском университете (протокол №235 от 29.09.2021).

Исследование выполнено in vitro на 9 образцах (по 3 образца в каждой группе исследования). В группе 1 интактные образцы – Cerabone (Botiss biomaterials GmbH, Германия). В группе 2 – Cerabone (Botiss biomaterials GmbH, Германия), но после дегазации и экстракции пыли по разработанному нами методу [12].

Метод дегазации и экстракции пыли реализуется в 2 этапа. Первый этап – пассивная дегазация и экстракция пыли (удаление крупнодисперсной фракционной пыли и воздуха с поверхностей и пустот). Данный этап осуществляли в физиологическом растворе. В термостате температуру физиологического раствора доводили до +37°С. В пробирку помещали фракцию ГКМ, заливали физиологическим раствором в соотношении 1:2, где на каждый мл ГКМ добавляли 2 мл физиологического раствора и инкубировали в термостате при температуре +37°С. Через 20 минут отделяли фракцию ГКМ от физиологического раствора с помощью пипеточного дозатора (дозатор механический одноканальный с переменным объемом 20–200 мкл). Второй этап – активная дегазация и экстракция (удаление мелкодисперсной фракционной пыли и остаточных газов из устьев межпоровых каналов и пустот). Согласно данным [13], фракцию ГКМ заливали раствором лимонной кислоты (pH1) при +37°С на 10 минут. Насыщенный раствор кислоты готовили путем медленного добавления безводной лимонной кислоты к 50 мл дистиллированной воды с использованием магнитной мешалки (Microfix, JP Selecta) для перемешивания раствора. Добавление кристаллов лимонной кислоты проводили до получения рН 1, который определяли с помощью рН-метра. К каждому мл ГКМ добавляли 2 мл лимонной кислоты с рН 1 и инкубировали при +37°С в течение 10 минут. После десяти минут нахождения ГКМ в растворе лимонной кислоты запускали ультразвуковые генераторы и проводили активную дегазацию и экстракцию пыли в ультразвуковой ванне (УЗУ - 0,25, Россия) с частотой 18 кГц, мощностью 250 Вт и временем экспонирования 60 секунд. После обработки ультразвуком лимонную кислоту отделяли от материала с помощью пипеточного дозатора. Для удаления остатков кислоты фракцию ГКМ помещали в физиологический раствор при температуре +37°С и ультразвуковую ванну (УЗУ - 0,25, Россия) с частотой 18 кГц, мощностью 250 Вт и временем экспонирования 60 секунд.

В группе 3 использовали в качестве контроля культуру мезенхимально-стромальных клеток (МСК), полученных из пупочного канатика человека.

Анализ фракции ГКМ, подготовленного по методу дегазации и экстракции пыли, на цитотоксичность

Для оценки цитотоксичности разработанного нами метода дегазации и экстракции пыли использовали МСК, полученные из пупочного канатика человека (донор №7000400025628), культуры 2-го пассажа. Жизнеспособность клеток при заморозке составляла 96%. Перед введением в эксперимент МСК размораживали на водяной бане при температуре +37°С в течение 2,5 минуты. В условиях ламинарного шкафа KS-12 Herasafe (Thermo Scientific, США) МСК двукратно отмыли от крио-протектора стерильным раствором фосфатно-солевого буфера (раствор Дальбекко (DPBS, «Биолот», Россия)). Жизнеспособность клеток перед введением в эксперимент составляла 94% в количестве 5,8 млн.

Образцы каждой группы помещали в культуральные чашки Петри 100 см² (SPL, Корея). В группах 1 и 2 на поверхность материала с помощью дозатора переменного объема переносили 500 000 клеток. В группе 3 использовали чашку Петри площадью 100 см² с таким же количеством посаженных клеток. Через 15 минут после введения клеточной суспензии в каждую культуральную чашку добавляли ростовую среду – α-MEM жидкая, с L-глутамином, стерильная («Биолот», Россия), 2mM L-глютамина (ООО «Биолот», Россия). Образцы в среде помещали в СО₂ инкубатор СВ 210 (Binder, Германия) и инкубировали при стандартных условиях в течение 8 суток. Ежедневно проводился визуальный осмотр культуры и оценивалась морфология клеток. На восьмые сутки чашки трипсинизировались (раствор трипсина-ЭДТА («ПанЭко», Россия)), производилась дезагрегация клеток с пластика.

Для оценки жизнеспособности МСК в культуре использовали счетчик клеток Countess II FL Automated Cell Counter (Thermo Fisher Scientific, USA). Определяли пролиферативный индекс и скорость удвоения культуры. Оценку морфологии культивируемых клеток проводили в динамике на всех этапах культивирования с помощью микроскопа AXIO Observer A1 (Carl Zeiss, Германия).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Фрагменты фракции ГКМ 1 и 2 групп устанавливали на углеродную проводящую ленту с двойным покрытием, затем напыляли золотом с использованием UNICOAT 600t. Топографический анализ поверхности образца проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа Tescan Vega с микроанализатором Inga Energy (TES-CAN, Чехия) в режиме обнаружения вторичных электронов. Рабочее расстояние корректировали для получения подходящего увеличения. Ускоряющее напряжение было установлено 30 кВ.

Фрагменты фракции ГКМ 1 и 2 групп после культивирования фиксировали в 4% формальдегиде на фосфатном буфере Ph 7.0-7.4. Перед исследованием препараты высушивались естественным образом при комнатной температуре в течение 10 минут. Дополнительная химическая дегидратация не проводилась. Препараты устанавливали на алюминиевые столики и крепили с помощью двустороннего карбонового скотча (SPI, США), напыляли золотом в SPI-Module Sputter Coater (SPI, США), толщина слоя 5 нм. Анализировали в сканирующем двулучевом ионно-электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, США) в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ.

Статистический анализ

Для статистического анализа использовали программное обеспечение: SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, New York, USA). Для оценки скорости дегазации проводили эксперимент в трех повторностях. Фиксировали объем жидкости каждые 2,5 минуты. В интервале от 0 минут (начало дегазации) до 20 минут (окончание выхода пузырьков газа) в каждый изучаемый момент времени вычисляли среднее арифметическое оставшегося объема жидкости, его стандартное отклонение, ошибку средней, границы 95% доверительного интервала. Экспериментальные данные – 9 временных точек по 3 измерения в каждой, итого 27 пар наблюдений – с высокой степенью точности сглаживаются 4-параметрической логистической кривой, уравнение которой в общем виде следующее:

f(t) = d+ (c-d) / (1 + exp(-a(t-b))),

где:

f(t) – процент от исходного объема жидкости; t – время в минутах; d – максимальный процент (без дегазации), в настоящем исследовании мы приняли его равным 100%; с – параметр, отражающий минимальный процент исходного объема жидкости после завершения дегазации; a – параметр, отражающий скорость дегазации; b – параметр, характеризующий время, в которое происходит половинная дегазация.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Опытным путем мы установили, что на стадии пассивной дегазации при погружении фракции ГКМ на 20 минут в физиологический раствор при +37ºС из ГКМ происходит выделение пузырей газа и мелкодисперсной пыли (рисунок 1).

Рисунок 1. ГКМ Cerabone на этапе пассивной дегазации и экстракции пыли

Figure 1. GOM Cerabone at the stage of passive degassing and dust extraction

На рисунке 2 видно, что начальный спуск кривой наблюдается через 2,5 минуты после погружения ГКМ в физиологический раствор при +37ºС, что соответствует уменьшению исходного объема жидкости и выделению пузырей газа из ГКМ. Наибольшее выделение пузырей газа происходит между 7,5 до 12,5 минуты. С 13 по 17 минуту образуется мелкодисперсная пыль в виде взвеси. Затем следует плато между 17,5 и 20 минутами, когда выделения пузырей газа выявлено не было.

Рисунок 2. Этап пассивной дегазации и экстракции пыли ГКМ

Figure 2. Stage of passive degassing and extraction of GOM dust

Мы определили изменения исходного объема жидкости при дегазации и экстракции пыли, средние значения и их 95% доверительные интервалы (таблица 1).

Таблица 1. Процент исходного объема жидкости в зависимости от времени: средние значения и их 95% доверительные интервалы

Table 1. Percentage of initial fluid volume versus time: mean values and their 95% confidence intervals

В среде статпакета SPSS проведена аппроксимация наблюдаемых значений S-образной функцией – 4-параметрической логистической регрессией. Получены следующие значения регрессионных коэффициентов и их стандартных ошибок, отражающие параметры зависимости процента дегазации от времени: A 0,51±0,04; B 10,10±0,17; C 81,01±0,35.

Уравнение зависимости процента дегазации от времени t следующее:

f(t) = 100+ (81,01 – 100) / (1 + exp (-0,51 (t – 10,10))).

Коэффициент детерминации построенной модели R2=99%, что характеризует ее как очень точную.

Согласно построенной математической модели процесса дегазации и экстракции пыли установлено, что через 10 минут происходит выход половины имеющегося в пустотах ГКМ газа, а через 20 минут от начала дегазации и экстракции пыли кривая выходит на плато.

СЭМ

Проведенный топографический анализ поверхности образцов 1 и 2 групп для определения площади наружных и внутренних поверхностей каналов и пор, объема пор и каналов, а также отношения пор к каналам в ГКМ позволил выявить, что исследуемые образцы Cerabone обладают сквозными каналами внутри частиц с распределением по размерам от 50 до 190 мкм.

После проведения подготовки исследованных фракций ГКМ группы 2 методом дегазации и экстракции пыли мы выявили уменьшение содержания крупнодисперсной и мелкодисперсной фракционной пыли на наружных и внутренних поверхностях пор и устьев межпоровых каналов и пустот во всех образцах группы 2 (рисунок 3). Площадь свободных поверхностей пор и устьев сквозных пор увеличилась.

Рисунок 3. СЭМ-микрофотографии, Cerabone

Figure 3. SEM micrographs, Cerabone

Примечания. ДО * – поверхность исследованных ГКМ группы 1 без подготовки по методу дегазации и экстракции пыли. На наружных и внутренних поверхностях визуализируется крупнодисперсная и мелкодисперсная фракционная пыль. ПОСЛЕ * – поверхность исследованных ГКМ группы 2, подготовленных по методу дегазации и экстракции пыли. Наружные поверхности ГКМ освободились от крупнодисперсной фракционной пыли, внутренние поверхности пор и устьев межпоровых каналов и пустот – от мелкодисперсной пыли.

Анализ фракции ГКМ, подготовленный по методу дегазации и экстракции пыли, на цитотоксичность

Исследование показателей жизнеспособности МСК человека в культуральной среде in vitro показало, что количество снятых клеток не имеет значительных расхождений в группах 1 и 2, группы 1 и 2 сопоставимы между собой и группой 3 (таблица 2).

Таблица 2. Показатели жизнеспособности МСК в культуре, их пролиферативного индекса, скорости удвоения культуры и описательная статистика в виде средних и стандартных отклонений (M±SD)

Table 2. Indicators of viability of mesenchymal-stromal cells in culture, their proliferative index, culture doubling rate and descriptive statistics in the form of mean and standard deviations (M±SD)

На всем протяжении культивирования МСК имели типичную веретенообразную морфологию, края цитоплазмы ровные; признаков апоптоза отмечено не было. При микроскопическом исследовании в 1 и 2 группах отмечалось краевое прикрепление МСК к поверхностям гранул ГКМ (рисунок 4).

Рисунок 4. а – ГКМ Cerabone без подготовки по методу дегазации и экстракции пыли, группа 1; b – ГКМ Cerabone, подготовленный по методу дегазации и экстракции пыли, группа 2; с – контроль – группа 3. 1 – Cerabone, 2 – культивируемые МСК человека

Figure 4. a – GOM Cerabone without preparation according to the protocol of degassing and dust extraction, group 1; b – the GOM Cerabone, prepared according to the protocol of degassing and dust extraction, group 2; c – control – group 3. 1 – Cerabone, 2 – cultured human MSC

Таким образом, подготовленная к использованию фракция ГКМ по разработанному нами методу дегазации и экстракции пыли не оказывает токсического воздействия на рост и жизнеспособность клеточной культуры МСК человека. Мы не выявили цитотоксического влияния на МСК человека, размещенные на фракции ГКМ и культивируемые in vitro (рисунок 5).

Рисунок 5. СЭМ. МСК человека, размещенные на ГКМ на культуральной среде in vitro. А. Прикрепление, миграция и пролиферация клеток на поверхности ГКМ, х2000; В. МСК через 8 дней после размещения на ГКМ, х8000

Figure 5. SEM of MSC placed on GOM in vitro on a culture medium. A. Attachment, migration and proliferation of cells on the surface of the GOM, x2000; B. MSC 8 days after placement on the GOM, x8000

ОБСУЖДЕНИЕ

Ксеногенные ГКМ бычьего происхождения известны своей биосовместимостью, низкой скоростью резорбции или ее отсутствием, а также сходством с человеческой костью за счет сохраненной микроструктуры костного каркаса [14–16].

Мы использовали коммерчески доступный ксеногенный ГКМ Cerabone (Botiss biomaterials GmbH, Германия). Cerabone производится путем трехступенчатой температурной обработки, включая окончательное спекание при температуре >1200°C, в результате чего удаляются все органические соединения и потенциальные прионы, бактерии и вирусы. Кроме того, высокая температура спекания повышает кристалличность и стабильность объема [17, 18]. Сообщалось, что спеченный при высокой температуре Cerabone показал лучшую жизнеспособность клеток остеобластов человека и их метаболическую активность по сравнению с другими ГКМ бычьего происхождения, приготовленными при более низких температурах [19, 20].

Необходимым условием для оптимизации репаративного остеогенеза и увеличения площади поверхности фракции ГКМ считается наличие макропор [21, 22]. Поры с большими размерами в диаметре улучшают диффузию кислорода во внутренние пространства ГКМ, это повышает жизнеспособность клеток [23]. Считается, что бимодальное распределение пор со средним размером 38,3 мкм повышает эффективность посева клеток, жизнеспособности клеток и пролиферации [24].

Успех устранения костных дефектов челюстей методом направленной костной регенерации определяется способностью ГКМ к прогрессивному клеточно-тканевому росту по всему объему.

Известно, что пролиферативная активность на поверхностях гранул при наличии пыли существенно снижается [25]. На этапах производственного цикла в каналах ГКМ создаются препятствия из пыли и воздушных пробок. Эта физическая причина приводит к подавлению миграции факторов роста кости и продвижению внутрь фракции ГКМ сосудов и волокнистых структур из реципиентного ложа и мягкотканного окружения. Сосудистая система является не только источником кислорода и питательных веществ, необходимых для остеогенной дифференцировки, но и несет с собой кроме биологически активных веществ еще и МСК, способные дифференцироваться в ангиогенные клетки [26, 27]. Ангиогенные источники клеток, такие как эндотелиальные клетки или остеопрогениторные клетки, являются центральным и основным источником неоваскуляризации, участвуют в васкулогенезе и могут стимулировать неоангиогенез. Таким образом, недостаток кислорода и питательных веществ препятствует миграции клеток на расстояние более 500 мкм от поверхности гранул и снижает их выживаемость [28].

Следовательно, для повышения дренажных возможностей ГКМ необходимо проводить подготовку фракции ГКМ нашим методом дегазации и экстракции пыли. СЭМ показала, что после проведения дегазации и удаления производственной пыли на наружных и внутренних поверхностях гранул в порах и устьях каналов сквозных пор произошло уменьшение содержания крупнодисперсной и мелкодисперсной пыли. Таким образом, на этапе пассивной дегазации освобождаются наружные поверхности фракции ГКМ от крупнодисперсной пыли и воздуха. На этапе активной дегазации освобождаются внутренние поверхности пор, сквозных пор и пустот гранул ГКМ от мелкодисперсной пыли и остаточных газов. Ультразвук, используемый на этапе активной дегазации, создает эффект кавитации, который инициирует гидроудары на наружно-внутренних поверхностях гранул, неровности этих поверхностей приводят к возникновению интерференции и дифракции волн, в результате чего происходит выход газов и свободнолежащей мелкодисперсной пыли из гранул материала в омывающую жидкость. Наблюдается стабильный процесс удаления гидродинамических заслонок за счет объединения мелких воздушных пузырей в крупные с последующим их схлопыванием и выделением из пространств ГКМ в омывающий раствор [29]. Очищенные поры и каналы сквозных пор увеличивают площадь контакта факторов роста кости с внутренними поверхностями фракции ГКМ компонентов микроциркуляторного русла и жидкости, клеточных элементов, мигрирующих с периферии реципиентного ложа в глубь ГКМ.

ВЫВОДЫ

1. Предварительная подготовка ГКМ по разработанной нами методике дегазации и экстракции пыли в клинических условиях ex tempore значительно оптимизирует адсорбционные и дренажные свойства фракции ГКМ.
2. Увеличение соотношения площади свободных поверхностей к объему наружных и внутренних пространств фракции ГКМ повышает диффузию тканевой жидкости и плазмы крови, оптимизирует фиксацию и миграцию клеток, создает условия для инвазии кровеносных сосудов и неоангиогенеза в свободных пространствах фракции ГКМ.

Конфликт интересов: автор заявляет об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

D. V. Malchikova

Author for correspondence.
Email: dvmalchikova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9077-2888

a postgraduate student of the Department of Maxillofacial Surgery and Dentistry

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1. GOM Cerabone at the stage of passive degassing and dust extraction

Download (845KB)

Indexing metadata

3. Figure 2. Stage of passive degassing and extraction of GOM dust

Download (729KB)

Indexing metadata

4. Figure 3. SEM micrographs, Cerabone

Download (967KB)

Indexing metadata

5. Figure 4. a – GOM Cerabone without preparation according to the protocol of degassing and dust extraction, group 1; b – the GOM Cerabone, prepared according to the protocol of degassing and dust extraction, group 2; c – control – group 3. 1 – Cerabone, 2 – cultured human MSC

Download (1MB)

Indexing metadata

6. Figure 5. SEM of MSC placed on GOM in vitro on a culture medium. A. Attachment, migration and proliferation of cells on the surface of the GOM, x2000; B. MSC 8 days after placement on the GOM, x8000

Download (129KB)

Indexing metadata