ANALYsis oF RYRRoLIDiNopHENoNE DERivATivEs iN BioLoGiOAL FLuiDs

Full Text

Введение Производные пирролидинофенона - одна из групп синтетических катинонов, которые представляют собой структурные аналоги фенилалкиламина. К данной группе относятся пирролидинопропиофенон (PPP), a-пирролид инобутиофенон (a-PBP), a-пирролидиновале-рофенон (a-PVP), a-пирролидиногексиофе-нон (a-PHP), 3,4-метилендиоксибутиофе-нон (MDPBP), 3,4-метилендиоксипировале-рон (MDPV). В настоящее время все производные пирролидинофенона являются контролируемыми соединениями и входят в Список I перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю на территории Российской Федерации как производные N-метилэфедрона. Исключение составляет метилендиоксипиро-валерон, который включен в Список I в качестве самостоятельной позиции [4]. В рамках химико-токсикологического анализа при медицинском освидетельствовании живых лиц данная группа наркотических средств подлежит обязательному исследованию [5]. Актуальность изучения данной группы наркотических средств вызвана их токсикологическим значением, которое определяется доступностью этих веществ и высокой летальностью при употреблении. В ряде регионов Приволжского федерального округа в 2016 г. частота обнаружения синтетических катино-нов при медицинском освидетельствовании живых лиц составляет 33 % от общего числа исследований. В 2017 г. отмечен рост данного показателя до 42 %. Следует отметить, что при судебно-химических исследованиях в этих же регионах данные вещества выявляются относительно редко. Наиболее употребляемый синтетический катинон - 3,4-метилендиокси-пировалерон, который относится к «дизайнерским» наркотическим средствам и является основным компонентом так называемых «солей для ванн» [1]. В настоящем обзоре рассмотрены пути биотрансформации, методы подготовки проб к исследованию и методы анализа производных пирролидинофенона при проведении химико-токсикологического анализа. Механизмы биотрансформации производных пирролидинофенона Биотрансформация производных пирро-лидинофенона является ключевым моментом, определяющим характер пробоподготовки проб и процедуры последующего анализа. Большинство исследований биотрансформации производных пирролидинофенона проводилось на лабораторных животных, а также клетках печени человека. Продукты биотрансформации идентифицировали при помощи хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) и высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Были определены основные пути биотрансформации изучаемых веществ для дальнейшей идентификации «маркерных» метаболитов в объектах исследования биологического происхождения - крови, моче, желчи, печени, волосах [2, 13, 18, 19]. Основные метаболические реакции производных пирролидинофенона: окисление алкильной цепи (алифатическое гидроксилирова-ние с последующим окислением до кетонной группы), окисление пирролидинового кольца (с образованием лактамов), восстановление кетонной группы до алифатической гидроксильной группы и разрушение пирролидино-вого кольца с образованием первичного амина (рис. 1). Метилендиокси-производные пирролиди-нофенона подвергаются дезалкилированию с последующим метилированием одного из образующихся фенольных гидроксилов (рис. 2). Метаболиты а-пирролидиновалерофенона и 3,4-метилендиоксипировалерона, содержащие фенольную гидроксильную группу, способны образовывать конъюгаты с глюкуроно-вой кислотой (табл. 1). В большинстве случаев химико-токсикологический анализ производных пирроли-динофенона направлен на обнаружение «маркерных» метаболитов, концентрация которых в исследуемых пробах не превышает 100,0 нг/мл. При идентификации а-пирро-лидиновалерофенона «маркерным» метаболитом является 1-(1-оксо-1-фенилпентан-2-ил) пирролидин-2-он; 3,4-метилендиоксипировалерона - 1-[1-(1,3-бензодиоксол-5-карбонил) бутил] пирролидин-2-он, продукты реакции окисления пирролидинового кольца [13, 18]. Подготовка биологических проб к исследованию на производные пирролидинофенона При подозрении на отравление наркотическими средствами и психотропными веществами в обязательном порядке проводится судебно-химическое исследование крови, мочи и желчи [6]. Объектами исследования при проведении клинического химико-токсикологического анализа и химико-токсикологического анализа при медицинском освидетельствовании живых лиц становятся биологические жидкости - кровь и моча pharmacy Рис. 1. Схема биотрансформации а-пирролидиновалерофенона Fig. 1. The metabolism of а-PVP Рис. 2. Схема биотрансформации 3,4-метилендиоксипировалерона Fig. 2. The metabolism of MDPV ■ ■■ ФАРМАЦИЯ Основные метаболиты а-пирролидиновалерофенона и 3,4-метилендиоксипировалерона Main metabolites of а-pvp and MDpv № метаболиты а-пирролидиновалерофенона метаболиты 3,4-метилендиоксипировалерона 1 1-фенил-2-(пирролидин-1-ил)-пентан-1-он (a-PVP) 1-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-2-пирролидин-1-ил-пентан-1-он (MDPV) 2 1-(1-оксо-1-фенилпентан-2-ил)пирролидин-2-он 1-[1-(1,3-бензодиоксол-5-карбонил)бутил] пирролидин-2-он 3 1-(4-гидроксифенил)-2-пирролидин-1-илпентан-1-он 1-(3,4-дигидроксифенил)-2-пирролидин-1-илпентан-1-он 4 1-фенил-2-пирролидин-1-ил-пентан-1-ол 4-[1[(1,3-бензодиоксол-5-карбонил)бутиламино] бутановая кислота 5 4-гидрокси-1-фенил-2-пирролидин-1-ил-пентан- 1-он 1-[1-(3,4-дигидроксибенз оил)бутил] пирролидин-2-он 6 1-[1-(4-гидроксибензоил)бутил] пирр олидин-2-он 4-[[2-(3,4-дигидроксифенил)-2-оксо-этил]амино] бутановая кислота 7 2-амино-1-фенил-пентан-1-он 1-(3-гидрокси-4-метокси-фенил)-2-пирролидин- 1-ил-пентан-1-он 8 4-(1-бензоилбутиламино)бутановая кислота 1-[1-(3-гидрокси-4-метокси-бензоил)бутил] пирролидин-2-он 9 4-[(1-бензоил-3-оксо-бутил)амино]бутановая кислота 4-[1-(3-гидрокси-4-метокси-бензоил) бутиламино]бутановая кислота 10 2-амино-1-(4-гидроксифенил)пентан-1-он - 11 1-[1-[гидрокси(фенил)метил]бутил] пирр олидин-2-он - 12 2-амино-1-фенил-пентан-1-ол соответственно. Схема подготовки проб мочи и крови для ненаправленного скрининга «маркерных» метаболитов производных пирролидинофенона состоит из последовательных этапов кислотного гидролиза, изолирования анализируемых веществ из биообъекта при помощи жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) смесями хлороформа и н-бутанола (неполярными экстрагентами) и последующей дериватизации метилирующими, ацетилирующими, либо силилирующими реагентами [14, 20, 26]. Широко применяется вариант подготовки проб с применением ферментативного гидролиза и твердофазной экстракцией (ТФЭ) на обращенно-фазных и смешанных сорбентах [3, 9]. Ферментативный гидролиз с последующей ТФЭ позволяет добиваться получения низких пределов обнаружения для нативных веществ и «маркерных» метаболитов (до 0,5 и 1,0 нг/мл для а-пирролидиновалерофенона и 3,4-метилендиоксипировалерона соответственно) при использовании малых объемов проб биологических жидкостей. Это возможно за счет разделения анализируемых веществ кислотного и основного характера, балластных веществ, высокой степени концентрирования. При использовании ТФЭ отмечено достоверное повышение отношения «сигналшум» при последующем хроматографическом анализе. Недостаток подобной схемы подготовки проб к исследованию - достаточно сложная по сравнению с ЖЖЭ техника пробоподготовки, требующая дорогостоящих расходных материалов и квалифицированного персонала, что приводит к повышению экономических затрат на исследование, а также ряд ограничений к использованию этой схемы пробоподготовки при ненаправленном химико-токсикологическом анализе [3, 9]. анализ производных пирролидинофенона и их «маркерных» метаболитов В качестве скринингового метода для идентификации компонентов биологических проб, предположительно содержащих наркотические средства, психотропные вещества и их метаболиты, в настоящее время эффективно применяется ГХ-МС [16, 27, 30]. Преимущество метода - удовлетворительная воспроизводимость результатов исследования Хромато-масс-спектрометрические характеристики а-пирролидиновалерофенона, 3,4-метилендиоксипировалерона и их «маркерных» метаболитов GC-MS characteristics of а-pvp, MDpv and primary metabolites название вещества характеристический ион, m/z (интенсивность, %) индекс удерживания а-пирр олидинов алерофенон 77 (15); 84 (8); 105 (7); 126 (100); 188 (2) 2185 1-(1-оксо-1-фенилпентан-2-ил) пирролидин-2-он 77 (16); 86 (12); 98 (39); 105 (8); 140 (100) 1875 3,4-метилендиоксипир ов алер он 84 (7); 121 (5); 126 (100); 149 (8); 232 (2) 2110 1-[1-(1,3-бензодиоксол-5-карбонил) бутил]пирр олидин-2-он 86 (41); 98 (84); 121 (24); 140 (100); 149 (41); 206 (61) 2330 и возможность идентификации анализируемого вещества по двум критериям: времени удерживания и масс-спектру вещества. В табл. 2 представлены значения параметров удерживания и основные характеристические ионы масс-спектров электронного удара (m/z) для производных пирролидинофенона и некоторых «маркерных» метаболитов [7, 12, 13, 18, 21, 25]. В качестве параметров удерживания используются индексы удерживания Ковача, полученные при газохроматографическом анализе на капиллярных колонках с неполярными неподвижными фазами. При ГХ-МС-исследовании возможно выполнение анализа в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) по заданным ионам. Для изучаемых соединений наиболее интенсивными в масс-спектрах считаются ионы с m/z 126 (пирролидиновый фрагмент) и 140 (оксо-производное пирролидина). Следует отметить, что данные ионы находятся в «неинформативном» диапазоне - менее 150 а. е. м., поэтому на результаты идентификации, возможно, сильно влияют компоненты матрицы исследуемого образца и «фона» хроматографической колонки. Для устранения вышеуказанных недостатков целесообразно применение дериватизации - ацетилирования и силилирования [3, 9]. Альтернативный вариант при скрининге биологических жидкостей - иммунохимический анализ. Применение методов иммунохимического анализа в практике химико-токсикологических исследований обеспечивает экспрессность и снижение дополнительной нагрузки на дорогостоящее хроматографическое оборудование. В литературных источниках имеются данные о ряде иммунохимических тест-систем, с помощью которых возможно проводить исследования биологических объектов, содержащих производные пирролидинофенона [8, 10, 11, 17, 23, 24]. На территории РФ для проведения вышеуказанных исследований к использованию рекомендованы биосенсорные системы IK 200609. В основе метода лежат иммунохроматографические и иммуноферментные способы определения анализируемых веществ. Количественное определение осуществляется путем сравнения интенсивности окрашивания зоны детекции на биосенсоре с фиксированной информацией об интенсивности окрашивания стандартного образца анализируемого вещества. Предел обнаружения метода при определении синтетических катинонов в моче составляет 20 нг/мл [24]. В практике химико-токсикологического анализа в США применяются аналитические тест-системы Randox DOA-V, в основе которых лежит метод конкурентного иммуноферментного взаимодействия, с использованием одиннадцати типов поликлональных антител, два из которых специфичны синтетическим катинонам. Первый тип антител специфичен к меткатинону, второй тип - к 3,4-метилендиоксипировалерону/3,4-мети-лендиоксибутиофенону [10]. Прочие синтетические катиноны проявляют способность к кросс-реактивности с вышеуказанными антителами, что является основным недостатком всех иммунохимических методов анализа [11, 23]. Валидационные исследования метода с применением тест-системы Randox DOA-V проводились путем анализа около 20000 образцов мочи, при этом положительные результаты подтверждались методом ВЭЖХ-МС/МС. Предел обнаружения метилендиоксипировалерона при исследовании образцов мочи составил 9,2 нг/мл. Для метода соблюдается линейность в диапазоне концентраций 30,0-1050,0 нг/мл, коэффициент детерминации г2 достоверно превышает значение 0,98 [10]. Прочие иммунохимические методы имеют недостаточный уровень доказательности по pharmacy ФАРМАЦИЯ ■■ ■■ достоверности идентификации или не обладают приемлемым для рутинного анализа показателем селективности к производным пир-ролидинофенона [8, 17]. Рассмотрены варианты количественного определения производных пирролидинофе-нона в образцах крови и мочи при летальных отравлениях [15, 22, 28, 29]. Описан случай летального отравления 3,4-метилендиоксипи-ровалероном, концентрация которого в крови составила 1200,0 нг/мл, также в крови был обнаружен а-пирролидиновалерофенон. Авторами в дополнение к исследованию крови был выполнен секционный анализ проб волос, в результате которого был обнаружен 3.4- метилендиоксипировалерон в количестве 20,0 нг на 10 мм волос. Предел обнаружения 3.4- метилендиоксипировалерона в крови составил 1,0 нг/мл. Рабочие диапазоны методики количественного определения методом ГХ-МС составили 2,0-2000,0 нг/мл для крови и 0,05-50,0 нг/10 мм для волос [28]. Исследованы закономерности посмертного распределения 3,4-метилендиоксипиро-валерона в крови, печени, почках, головном мозге, мышцах, спинномозговой жидкости и волосах; установлено, что его летальная концентрация составляет около 4,0 мкг/мл. Диапазон определяемых концентраций в волосах для метода ВЭЖХ-МС/МС составил 2,0-3000,0 пг/мг [15]. Метод ВЭЖХ-МС/МС с тройным квадру-полем в режиме мониторинга множественных молекулярных реакций позволяет добиться практически полного подавления «шумов» аналитического фона образца и получать пределы обнаружения и количественного определения для 3,4-метилендиоксипировалерона в трупной крови на уровне 10-100 пкг/мл и 1-10 нг/мл соответственно. Одно из преимуществ вышеуказанной ВЭЖХ-МС/МС-системы - возможность масс-спектрометрического скрининга. Для количественного определения нативного 3.4- метилендиоксипировалерона применяли метод внутреннего стандарта, в качестве которого использовали ё3-метилон [29]. Заключение Таким образом, производные пирролиди-нофенона имеют токсикологическое значение, поэтому вопросы методического и материально-технического обеспечения их анализа в биологических жидкостях актуальны в течение последнего десятилетия. Наиболее распространены на территории РФ а-пирро-лидиновалерофенон и 3,4-метилендиоксипи-ровалерон - наркотические средства, которые относятся к категории так называемых «дизайнерских» наркотических средств. В настоящее время вышеуказанные вещества достаточно сложны для исследования в большинстве экспертных учреждений, что обусловлено рядом факторов: • невысоким уровнем концентрации производных пирролидинофенона в биологических объектах (в плазме крови не превышает 200,0 нг/мл); • интенсивной биотрансформацией и образованием большого количества метаболитов, среди которых необходимо определять «маркерные» метаболиты; • невозможностью дифференциации различных производных пирролидинофено-на и их метаболитов в ходе хромато-масс-спектрометрического скрининга; • отсутствием достаточного количества доступных иммунохимических тест-систем для рутинного анализа; • необходимостью применения для идентификации и количественного определения в биологических объектах высокотехнологичного и дорогостоящего метода анализа - ВЭЖХ МС/МС; • отсутствием на территории РФ доступных коммерческих стандартных образцов веществ, относящихся к производным пир-ролидинофенона. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

IV. V Synbulatov

Samara State Medical University

Email: only.rodis@gmail.com
Postgraduate Student, Department of Chemistry of Pharmaceutical Faculty, Samara State Medical University Samara, Russia

A. V Voronin

Samara State Medical University

Email: dimmu2000@mail.ru
Candidate of Pharmaceuticals Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Chemistry of Pharmaceutical Faculty Samara, Russia

T. V Voronina

Samara Regional Bureau of Forensic Medical Expertise

Email: dimmu.81@mail.ru
Forensic expert of the Forensic Chemistry Department, Samara Regional Bureau of Forensic Medical Expertise Samara, Russia

References

Supplementary files