The development of approaches to the standardization of the syringa vulgaris leaves
- Authors: Serebryakova A.D.1, Kurkin V.A.1
-
Affiliations:
- Samara State Medical University
- Issue: Vol 20, No 1-2 (2020)
- Pages: 158-163
- Section: Pharmacy
- URL: https://aspvestnik.ru/2410-3764/article/view/54535
- DOI: https://doi.org/10.17816/2072-2354.2020.20.1.158-163
- ID: 54535
Cite item
Full Text
Abstract
The article studies the problems of phytochemical research of Syringa vulgaris L. leaves, which are a perspective raw material containing flavonoids. As a result of the study, the optimal conditions for the extraction of flavonoids in the leaves of Syringa vulgaris were determined: 70% ethanol was used as an extragent; the ratio “raw material – extragent” was 1 : 50; extraction time was 45 min; the degree of fineness was 1 mm. The method of quantitative determination of the total flavonoids in the leaves of Syringa vulgaris by means of differential spectrophotometry with the use of state standard sample of rutin at a wave length of 412 nm was developed. The content of the total flavonoids for Syringa vulgaris leaves varies from 2,76% to 3,89% (calculated with reference to rutin). The error of a single determination with a 95% confidence probability is 6,12%.
Keywords
Full Text
Введение
Сирень обыкновенная (Syringa vulgaris L.) является одним из лекарственных видов растений, не включенных в Государственную фармакопею Российской Федерации XIV издания: в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС) зарегистрирована кора (ВФС 42-2106-92). Препараты на основе коры сирени обладают широким спектром фармакологической активности: иммуномодулирующим, адаптогенным, анксиолитическим и антидепрессивным действием. Кора сирени обыкновенной является источником получения ГСО cирингина (ВФС 42-2088-92 «Cирингин-стандартный образец»), который находит применение в стандартизации сырья и препаратов элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus Rupr. et Maxim) — элеутерозид В [3–5]. Также в коре сирени обыкновенной были обнаружены и выделены другие фенилпропаноиды (кониферин, актеозид, форзитиазид), фенольные соединения (тирозол, гидрокситирозол, салидрозид) и иридоид (олеуропеин) [3, 5]. Разработаны методики качественного и количественного анализа сырья «Сирени обыкновенной кора» и препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп» с использованием ГСО сирингина методами тонкослойной хроматографии, прямой спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии [3–7]. На наш взгляд, не менее интересными с точки зрения источника биологически активных соединений (БАС) являются и другие части растения, в том числе листья сирени обыкновенной, в которых среди потенциальных биологически активных соединений являются флавоноиды [8]. Известен опыт народного применения листьев сирени в качестве средства, обладающего противовоспалительными и антибактериальными свойствами, однако в настоящее время степень изученности химического состава данного вида сырья является недостаточной.
С целью введения листьев сирени обыкновенной в Государственную фармакопею Российской Федерации необходимо проведение комплекса фармакогностических исследований, включая разработку нормативной документации, подтверждающей качество ЛРС [2].
Цель настоящего исследования — разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной.
В задачи исследования входило:
- разработка методики количественного анализа суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной;
- определение содержания суммы флавоноидов для изучаемого вида сырья;
- определение нижнего предела содержания действующих веществ для листьев сирени обыкновенной.
Результаты и их обсуждение
Сирень обыкновенная — Syringa vulgaris L. — быстро растущее, широко распространенное растение на территории Российской Федерации [5].
Особый интерес, наряду с фармакопейным сырьем — корой, представляют листья данного растения, содержащие флавоноиды. Так, ранее из листьев были выделены производные кверцетина и кемпферола — рутин, изокверцетрин, кверцетрин и афзелин [8].
Объектом исследования служили листья сирени обыкновенной, заготовленные в мае и октябре 2015–2018 гг. в ботаническом саду Самарcкого университета, в г. Уральск, г. Тольятти и в Пензенской области.
В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной изучены ультрафиолетовые (УФ) спектры растворов водно-спиртовых извлечений из данного сырья (рис. 1 и 2). Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения сирени обыкновенной наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (рис. 1), как и в случае рутина (рис. 2). Изучение УФ-спектров Государственного стандартного образца (ГСО) рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм (рис. 2). В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной в дифференциальном варианте максимум поглощения обнаруживается также при длине волны 412 нм максимум поглощения (рис. 3), который соответствует максимуму поглощения раствора рутина.
Рис. 1. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной: 1 — раствор извлечения; 2 — раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида
Fig. 1. Electronic spectra of solutions of water-alcohol extraction from Syringa vulgaris leaves: 1 — solution of extraction; 2 — solution of extraction with aluminium chloride
Рис. 2. Электронные спектры спиртовых растворов рутина: 1 — исходный раствор; 2 — раствор с добавлением алюминия хлорида
Fig. 2. Electronic spectra of alcohol solutions of rutin: 1 — original solution; 2 — solution with aluminium chloride
Рис. 3. Электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной (дифференциальный вариант)
Fig. 3. The electronic spectrum of the solution of the water-alcohol extraction from the leaves of Syringa vulgaris (differential version)
Таким образом, рутин может быть использован в методике анализа в качестве ГСО.
С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов нами определены оптимальные условия экстракции флавоноидов в листьях сирени обыкновенной: экстрагент 70 % этиловый спирт; соотношение «сырье – экстрагент» — 1 : 50; время экстракции — извлечение на кипящей водяной бане в течение 45 мин; степень измельчения — 1 мм (табл. 1).
Таблица 1 / Table 1
Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из листьев сирени обыкновенной
Dependence of the recovery rate of total flavonoids from the leaves of Syringa vulgaris
Экстрагент | Соотношение сырье : экстрагент | Время экстракции, мин | Степень измельчения, мм | Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, % |
40 % этиловый спирт | 1:30 | 60 мин | 2 | 2,65 ± 0,16 |
60 % этиловый спирт | 1:30 | 60 мин | 2 | 3,10 ± 0,19 |
70 % этиловый спирт | 1:30 | 60 мин | 2 | 3,36 ± 0,21 |
80 % этиловый спирт | 1:30 | 60 мин | 2 | 3,27 ± 0,20 |
90 % этиловый спирт | 1:30 | 60 мин | 2 | 3,01 ± 0,18 |
70 % этиловый спирт | 1:30 | 30 мин | 2 | 2,64 ± 0,16 |
70 % этиловый спирт | 1:30 | 45 мин | 2 | 3,63 ± 0,22 |
70 % этиловый спирт | 1:30 | 90 мин | 2 | 3,11 ± 0,19 |
70 % этиловый спирт | 1:30 | 120 мин | 2 | 3,04 ± 0,19 |
70 % этиловый спирт | 1:30 | 45 мин | 2 | 3,26 ± 0,20 |
70 % этиловый спирт | 1:20 | 45 мин | 2 | 2,78 ± 0,17 |
70 % этиловый спирт | 1:50 | 45 мин | 2 | 3,38 ± 0,21 |
70 % этиловый спирт | 1:50 | 45 мин | 1 | 3,31 ± 0,20 |
70 % этиловый спирт | 1:50 | 45 мин | 2 | 2,79 ± 0,17 |
70 % этиловый спирт | 1:50 | 45 мин | 3 | 2,41 ± 0,15 |
Методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1 : 50) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 96 % этиловым спиртом до метки.
Примечание: Приготовление раствора рутина-стандартного образца. Около 0,020 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70 % этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70 % этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (испытуемый раствор Б рутина). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 412 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (раствор сравнения Б рутина).
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (x) вычисляют по формуле:
где D — оптическая плотность испытуемого раствора; Do — оптическая плотность раствора ГСО рутина; m — масса сырья, г; mo — масса ГСО рутина, г; W — потеря в массе при высушивании, %.
В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения — 240.
где D — оптическая плотность испытуемого раствора; m — масса сырья, г; mo — масса ГСО рутина, г; 240 — удельный показатель поглощения () ГСО рутина при 412 нм; W — потеря в массе при высушивании, %.
Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной представлены в табл. 2. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной с доверительной вероятностью 95 % составляет ±6,12 %.
Таблица 2 / Table 2
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной
Metrological characteristics of the method of quantitative determination of total flavonoids in the leaves of Syringa vulgaris
f | X, % | S | P, % | t (P, f) | ±X | E, % |
15 | 3,05 | 0,3367 | 95 | 2,13 | ±0,19 | ±6,12 |
Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов листьев сирени обыкновенной и рутина с алюминием хлоридом. Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,00880 до 0,03520 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,98953.
Правильность методики определяли методом добавок раствора рутина с известной концентрацией (25, 50 и 75 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 98 %.
С использованием разработанной методики нами проанализирован ряд образцов листьев сирени обыкновенной (табл. 3) и при этом определено, что содержание суммы флавоноидов варьирует от 2,76 до 3,89 %, что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела для сырья данного растения содержание суммы флавоноидов не менее 2,5 %.
Таблица 3 / Table 3
Содержание суммы флавоноидов в образцах листьев сирени обыкновенной
The content of total flavonoids in samples of Syringa vulgaris leaves
№ образца | Характеристика образца сырья | Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (%) в пересчете на рутин |
1 | Ботанический сад Самарского университета, г. Самара (май 2015 г.) | 3,79 ± 0,23 |
2 | г. Уральск (октябрь 2016 г.) | 2,94 ± 0,18 |
3 | Ботанический сад Самарского университета, г. Самара (май 2016 г.) | 3,89 ± 0,24 |
4 | г. Тольятти (май 2018 г.) | 2,76 ± 0,17 |
5 | Пензенская обл., Никольский р-н (май 2019 г.) | 3,12 ± 0,19 |
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности стандартизации листьев сирени обыкновенной путем определения суммы флавоноидов методом спектрофотометрии при аналитической длине волы 412 нм в пересчете на рутин.
Выводы
- Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина при аналитической длине волны 412 нм.
- Содержание суммы флавоноидов для листьев сирени обыкновенной варьирует от 2,76 до 3,89 %. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет ±6,12 %.
- Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для листьев сирени обыкновенной нижний предел содержания суммы флавоноидов не менее 2,5 %.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
About the authors
Anastasiya D. Serebryakova
Samara State Medical University
Author for correspondence.
Email: lazymoon93@mail.ru
Postgraduate student, Department of Pharmacognosy with Botany and Bases of Phytotherapy
Russian Federation, SamaraVladimir A. Kurkin
Samara State Medical University
Email: kurkinvladimir@yandex.ru
доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии
Russian Federation, SamaraReferences
- Белов Н.П., Гайдукова О.С., Панов И.А., и др. Лабораторный спектрофотометр для ультрафиолетовой области спектра // Известия высших учебных заведений. Приборостроение. – 2011. – Т. 54. – № 5. – С. 81–87. [Belov NP, Gaidukova OS, Panov IA, et al. Laboratory spectrophotometer for ultraviolet spectral region. Proceedings of higher educational institutions. Instrument making. 2011;54(5):81-87. (In Russ.)]
- Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. – М.: Медицина, 2018. [Gosudarstvennaya farmakopeya Rossiiskoy Federatsii. XIV ed. Moscow: Meditsina; 2018. (In Russ.)]
- Климова И.Ю. Аналитические и технические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной. – Самара, 2005. – 159 с. [Klimova IYu. Analiticheskiye i tekhnicheskiye issledovaniya po razrabotke novykh preparatov na osnove kory sireni obyknovennoy. Samara; 2005. 159 p. (In Russ.)]
- Куркин В.А., Маевская О.В., Браславский В.Б., и др. К вопросу о стандартизации лекарственного сырья, содержащего флавоноиды и фенилпропаноиды // Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности: материалы Всесоюзной конференции, Геленджик, 8–12 окт. 1990 г. – М.: Б. и., 1990. – С. 85–86. [Kurkin VA, Mayevskaya OV, Braslavsky VB, et al. K voprosu o standartizatsii lekarstvennogo syr’ya, soderzhashchego flavonoidy i fenilpropanoidy. (Conference proceedings) Primeneniye khromatografii v pishchevoy, mikrobiologicheskoy i meditsinskoy promyshlennosti: materialy Vsesoyuznoy konferentsii, Gelendzhik, 1990 October 8-12. Moscow: B. i.; 1990. Р. 85-86. (In Russ.)]
- Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для студентов фармац. вузов. Изд. 4-е, перераб. и доп. – Самара: Офорт, 2019. – 1278 с. [Kurkin VA. Pharmacognosy: A textbook for students pharmaceutical universities. 4th revised and updated. Samara: Ofort; 2019. 1278 p. (In Russ.)]
- Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Гриненко Н.А. Иридоиды коры Syringa vulgaris // Химия природных соединений. – 1990. – № 5. – С. 695–697. [Kurkin VA, Zapesochnaya GG, Grinenko NA. Iridoids of the bark of Syringa vulgaris. Сhemistry of Natural compounds. 1990;(5):695-697. (In Russ.)]
- Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Гриненко Н.А., и др. Фенольные соединения коры Syringa vulgaris // Химия природных соединений. – 1989. – № 4. – С. 581–582. [Kurkin VA, Zapesochnaya GG, Grinenko NA, et al. Phenolic compounds of the bark of Syringa vulgaris. Сhemistry of Natural compounds. 1989;(4):581-582. (In Russ.)]
- Запесочная Г.Г., Куркин В.А., Кривенчук П.Е. Флавоноиды и маннит из листьев Syringa vulgaris // Химия природных соединений. – 1980. – № 3. – C. 418–419. [Zapesochnaya GG, Kurkin VA, Krivenchuk PE. Flavonoids and mannitol from the leaves of Syringa vulgaris. Сhemistry of Natural compounds. 1980;(3):418-419. (In Russ.)]