Factors increasing the hydroxycinnamic acids extraction from dandelion roots

Full Text

Список сокращений

БАВ – биологически активные вещества; ГКК – гидроксикоричные кислоты; ЛРС – лекарственное растительное сырье; ГФ РБ – Государственная фармакопея Республики Беларусь; ЕФ – Европейская фармакопея; ДМСО – диметилсульфоксид.

ВВЕДЕНИЕ

Разработка ресурсосберегающих технологий использования лекарственного растительного сырья (ЛРС) и лекарственных препаратов на его основе остается актуальным направлением научных исследований в фармакогнозии [1]. С целью получения экстракционных лекарственных препаратов на сегодняшний момент используют различные методы экстрагирования, конечной целью которых является повышение выхода биологически активных веществ (БАВ) из ЛРС в экстрагент [2]. При этом для повышения эффективности экстракции целесообразно подобрать оптимальные ее параметры, обеспечивающие максимальный выход БАВ [3]. Особенно важно это для ЛРС с невысоким содержанием БАВ. К такому ЛРС можно отнести одуванчика лекарственного корни, в которых, согласно Государственной фармакопее Республики Беларусь (ГФ РБ), нормируется достаточно невысокое (не менее 0,3%) содержание гидроксикоричных кислот (ГКК) [4].

Содержание флавоноидов и фенольных кислот в корнях одуванчика зависит от года заготовки и составляет от 2,7 до 5,1% и от 0,5 до 0,9% соответственно [5]. Содержание фенольных соединений и фенольных кислот колеблется в зависимости от месяца заготовки: 0,3–0,5% и 0,2–0,5% соответственно [6].

При экстракции БАВ из корней 80% метанолом с последующим выпариванием при 40ºС в роторном аппарате и обработкой гексаном, этилацетатом, диэтиловым эфиром, бутанолом-1 и водой наибольшее количество фенольных соединений (21,1%) определено в этилацетатной фракции, которая содержит катехол (41,7 мг%), сиреневую (12,1 мг%), ванильную (7,7 мг%), кофейную (49,7 мг%), феруловую (40,1 мг%) и п-кумаровую (156,2 мг%) кислоты. Доминирующей фенольной кислотой является п-кумаровая кислота. В сравнительном плане этилацетатная фракция поглощает наибольшее число свободных радикалов: 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) (67,1%), 2,2′-азино-бис (3-этилбензтиазолино-6-сульфоновая кислота) (ABTS) (92,6%), супероксидный (23,5%) и гидроксильный (82,1%) радикалы и на 22,0% ингибирует перекисное окисление липидов [7].

Метанольное извлечение из корней получают в течение 3 ч при перемешивании при соотношении сырья и экстрагента 1 к 10 с последующей отгонкой растворителя при 40ºС в роторном аппарате и обрабатывают сухой остаток этилацетатом, гексаном, дихлорметаном и водой. Этилацетатная фракция содержит наибольшее количество фенольных соединений (228,7 мг/г), проявляет наибольшую способность поглощать радикалы DPPH (227,8 мг/г) и показывает значительные восстанавливающие свойства в отношении железа (III) (463,1 мг/г). Фракция содержит сиреневую (2,2 мг/г), кофейную (3,9 мг/г), ванильную (1,7 мг/г) и хлорогеновую (31,9 мг/г) кислоты, апигенин-7-глюкозид, лютеолин-7-глюкозид и нарингенин-7-глюкозид. Содержание индивидуальных флавоноидов менее 1 мг/г. Общее содержание фенольных соединений составляет 42,2 мг/г [8].

Метанольное извлечение из корней получают при комнатной температуре в течение одного часа при соотношении сырья и экстрагента 1 к 30, затем упаривают в роторном аппарате при 40ºС. Настой получают путем заливания корней кипящей водой и последующего настаивания при комнатной температуре в течение 5 мин, отвар – путем экстракции в кипящей воде в течение 5 мин. При этом настои и отвары в большей степени содержат цикориевую (5,95 мг/г), кофейную (0,55 мг/г) кислоты, лютеолин-7-глюкозид (4,26 мг/г), метанольное извлечение – лютеолин-7-рутозид (4,06 мг/г), лютеолин-7-гексозид (11,06 мг/г), лютеолин (4,26 мг/г). Метанольное и водные извлечения содержат приблизительно одинаковое количество 3,5- и 4,5-ди-О-кофеилхинных кислот (около 1,2 и 0,2 мг/г соответственно) и лютеолин-7-ацетилгексозида (примерно 0,2 мг/г). Значительный процент поглощения радикалов DPPH отмечен для метанольного извлечения и составляет 28,9% [9].

В извлечениях из корней, полученных при экстракции в течение 3 ч 50% метанолом на кипящей водяной бане, определено от 0,3 до 0,6 мг/г фенольных кислот (п-гидроксибензойная, хлорогеновая (72,7–173,2 мкг/г), кофейная и цикориевая (29,6–86,3 мкг/г) кислоты).

Таким образом, разные растворители, используемые для экстракции ГКК из одуванчика, извлекают разное количество этих БАВ, также на содержание БАВ влияют другие параметры экстракции, что актуализирует систематизацию данных по экстрагирующим свойствам в отношении ГКК разных по химической природе экстрагентов с последующей подборкой оптимальных параметров экстракции.

ЦЕЛЬ

Изучение влияния факторов экстракции на извлечение ГКК из одуванчика лекарственного корней.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили промышленные серии одуванчика лекарственного корней производства ООО «НПК Биотест», корни, заготовленные от дикорастущих форм в фазу отмирания надземной части в сентябре–октябре в окрестностях д. Новое поле, пр-та Дзержинского г. Минска и г. Калинковичи в 2020, 2021 и 2022 гг. и высушенные воздушно-теневым способом.

На первом этапе для изучения экстрагирующей способности в отношении ГКК выбраны следующие экстрагенты (все ч.д.а., ОДО «Химхром»): одноатомные спирты: метанол, этанол, пропанол-1, пропанол-2; дву- и многоатомные спирты: этиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль-1,2; кетон ацетон, нитрил ацетонитрил и сульфоксид диметилсульфоксид (ДМСО) и их водные растворы с объемной долей 20, 40, 60 и 80%, а также вода очищенная, бутанол-1, бутанол-2 и этилацетат. Данные экстрагенты отличались по полярности, вязкости, летучести, химическому строению и способности к отрыву протона [10].

Затем уточняли объемную долю экстрагента с наилучшей извлекающей способностью с шагом в 10%. Исследовали также экстрагирующую способность трехкомпонентных смесей, состоящих их двух органических растворителей и воды. Принцип выбора смеси включал комбинирование в разных объемных соотношениях растворителей с наибольшей экстрагирующей способностью и резко отличающейся летучестью. В случае, если наибольшей экстрагирующей способностью обладал летучий растворитель в составе водно-органического раствора, его долю уменьшали, вытесняя менее летучим растворителем.

Количественное спектрофотометрическое определение суммы ГКК в пересчете на хлорогеновую кислоту проводили по методике частной фармакопейной статьи «Одуванчика лекарственного корни» 07/2016:1852 из ГФ РБ, том 2 [4] на спектрофотометре Solar PB 2201 (ЗАО «Солар», Республика Беларусь).

Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы Microsoft Office Exсel 2016 (пакет «Анализ данных»). Каждое испытание выполняли три раза (n = 3; Р = 0,95). Результаты представляли в виде ± , где – среднее значение выборки; – полуширина доверительного интервала средней величины. Сравнение двух групп значений проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Влияние параметров экстракции на выход БАВ оценивали при помощи дисперсионного анализа. Значения статистически значимо различались при р < 0,05 [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рисунках 1, 2 и 3 представлены зависимости содержания ГКК от природы и объемной доли экстрагентов.

При экстракции метанолом и пропанолом-2 формировались по одному максимуму экстракции при объемной доле 60% (р = 0,0014) и 20% (р = 0,039) соответственно, с увеличением объемной доли пропанола-2 содержание ГКК снижалось (R2 = -0,9716). Экстракция пропанолом-1 и этанолом приводила к формированию двух максимумов при объемных долях 20% и 60% (6,9% (отн.), р = 0,20) и 40% (9,2% (отн.), р = 0,39) и 80% соответственно (рисунок 1).

 

Рисунок 1. Зависимость содержания ГКК от объемных долей одноатомных спиртов.

Figure 1. Dependence of the HCAs content on the volume fractions of monohydric alcohols.

 

Экстракция глицерином и пропиленгликолем-1,2 формировала по одному максимуму при 60% (р = 0,00035 и 0,0029) соответственно. Содержание ГКК не зависело от объемной доли глицерина (R2 = 0,1694) (рисунок 2).

 

Рисунок 2. Зависимость содержания ГКК от объемных долей многоатомных спиртов.

Figure 2. Dependence of the HCAs content on the volume fractions of polyhydric alcohols.

 

При экстракции ацетоном и ДМСО наблюдали плато максимальной экстракции при 40% и 60% (р = 0,41 и 0,57) соответственно, при этом при объемной доле 60% отмечены статистически значимое увеличение экстракции (р = 0,015 и 0,026) соответственно. Экстракция ацетонитрилом формировала максимум при 60% (р = 0,037) (рисунок 3).

 

Рисунок 3. Зависимость содержания ГКК от объемных долей прочих экстрагентов.

Figure 3. Dependence of the HCAs content from volume fractions of other extractants.

 

При экстракции бутанолом-1, бутанолом-2 и этилацетатом ГКК не обнаружены, вода извлекала 2,0±0,38% ГКК.

При экстракции 100% растворителями извлекающая способность в отношении ГКК минимальна по сравнению с водно-органическими растворами, которые извлекали ГКК больше в 1,6–3,9 раза. Экстрагирующая способность изучаемых в работе абсолютных растворителей уменьшалась в ряду: пропанол-1> этиленгликоль> ДМСО> метанол> вода> пропиленгликоль-1,2> ацетон> глицерин> этанол> ацетонитрил> пропанол-2.

Для оценки статистической значимости различий между максимумами экстракции ГКК из одуванчика лекарственного корней для различных объемных долей экстрагентов провели t-тест, результаты которого приведены в таблице 1.

 

Таблица 1 / Table 1

Результаты оценки статистической значимости различий по t-тесту между максимумами экстракции суммы ГКК для различных объемных долей экстрагентов

Results of the differences statistical significance assessment by the t-test between the maximum extraction of the HCAs sum for different volume fractions of extractants

	60% метанол	40% этанол	60% пропанол-1	20% пропанол-2	60% ацетон	60% ацетонитрил	60% ДМСО	40% этилен-гликоль	60% пропилен-гликоль-1,2	60% глицерин
60% метанол	-	0,0057	0,00084	0,0016	0,0017	0,0033	0,26	0,0087	0,019	0,0039
40% этанол	0,0057	-	0,00037	0,0066	0,029	0,018	0,011	0,25	0,00038	0,48
60% пропанол-1	0,00084	0,00037	-	0,0033	0,0028	0,0084	0,0031	0,00017	0,038	0,0023
20% пропанол-2	0,0016	0,0066	0,0033	-	0,18	0,048	0,035	0,026	0,0016	0,25
60% ацетон	0,0017	0,029	0,0028	0,18	-	0,36	0,022	0,026	0,017	0,022
60% ацетонитрил	0,0033	0,018	0,0084	0,048	0,36	-	0,052	0,021	0,0083	0,029
60% ДМСО	0,26	0,011	0,0031	0,035	0,022	0,052	-	0,0044	0,0021	0,0049
40% этиленгликоль	0,0087	0,25	0,00017	0,026	0,026	0,021	0,0044	-	0,0022	0,14
60% пропиленгликоль-1,2	0,019	0,00038	0,038	0,0016	0,017	0,0083	0,0021	0,0022	-	0,0058
60% глицерин	0,0039	0,48	0,00023	0,25	0,022	0,022	0,0049	0,14	0,0058	-

 

Статистически значимое максимальное извлечение ГКК происходило 60% пропанолом-1 (таблица 1), для которого уточнена объемная доля, обеспечивающая наибольшее извлечение ГКК (рисунок 4).

 

Рисунок 4. Уточнение объемной доли пропанола-1.

Figure 4. Clarification of the volume fraction of propanol-1.

 

В указанных выше литературных источниках [5–9] для экстракции ГКК из одуванчика используют водные растворы метанола, которые по экстрагирующей способности значительно уступают водным растворам пропанола-1.

Учитывая высокую экстрагирующую способность пропанола-1 в отношении ГКК одуванчика и летучесть, сопоставимую с водой, изучили влияние на экстракцию ГКК из одуванчика трехкомпонентных смесей, состоящих из воды, пропанола-1 и более летучих (метанол, ацетон) и менее летучих (этиленгликоль, ДМСО) растворителей (рисунок 5).

 

Рисунок 5. Зависимость содержания ГКК от соотношения долей растворителей в смеси экстрагентов при постоянной 40% объемной доле воды.

Figure 5. Dependence of the HCAs content on the ratio of solvent shares in the extractant mixture at a constant 40% volume fraction of water.

 

Изучение трехкомпонентных смесей показало, что экстрагирующая способность смеси при соотношении ацетона/пропанола-1 10/50 на 14,5% (отн.) (р = 0,25) больше, чем 60% пропанола-1.

В фармакопейной методике [4] определения ГКК в одуванчика лекарственного корнях в качестве экстрагента используется вода, которая извлекает данные вещества в 4,5 раза хуже, чем предложенная смесь растворителей.

При помощи дисперсионного анализа оценили влияние природы и объемной доли исследуемых экстрагентов на содержание ГКК (таблица 2).

 

Таблица 2 / Table 2

Результаты дисперсионного анализа влияния природы и объемной доли экстрагентов на содержание ГКК

Results of dispersion analysis of the nature and volume fraction of extractants influence on the HCAs content

Уровень значимости (р)
Диэлектрическая проницаемость (ε)	Динамическая вязкость (ɳ∙103, Па∙с)	Температура кипения, ºС	Относительная плотность, г/см3	Объемная доля метанола	Объемная доля этанола	Объемная доля пропанола-1
4,4×10-4	2,6×10-4	2,9×10-4	0,26	2,8×10-4	2,5×10-3	4,2×10-6
Объемная доля пропанола-2	Объемная доля ацетона	Объемная доля ацетонитрила	Объемная доля ДМСО	Объемная доля этиленгликоля	Объемная доля пропиленгликоля-1,2	Объемная доля глицерина
2,8·10-4	5,7×10-4	3,7·10-4	4,5×10-5	0,29	2,5·10-4	1,8·10-4

 

Диэлектрическая проницаемость, динамическая вязкость, температура кипения и объемные доли изучаемых экстрагентов в растворах статистически значимо (p < 0,05) влияли на выход ГКК при экстракции. Наибольшее влияние на экстракцию оказывала объемная доля пропанола-1 (таблица 2).

Пропанол-1 с диэлектрической проницаемостью, близкой к ацетону, но в шесть раз более вязкий и в 1,7 раза менее летучий, извлекал в 2,5 раза меньше суммы ГКК, чем ацетон. Пропанол-1 с диэлектрической проницаемостью и вязкостью, близкими к пропанолу-2, но в 1,2 раза менее летучий, извлекал в 4,5 раза больше суммы ГКК, чем пропанол-2.

На рисунках 6–10 представлены зависимости содержания ГКК от длительности, температуры экстракции, соотношения сырья и экстрагента, кратности экстракции размера частиц сырья соответственно.

 

Рисунок 6. Зависимость содержания ГКК от длительности экстракции.

Figure 6. Dependence of the HCAs content on the duration of extraction.

 

От получаса экстракции до полутора часов произошло снижение содержания ГКК на 39,5% (отн.) (р = 0,031) с минимумом на 1,5 ч, затем наблюдали плавное увеличение содержания ГКК к 6 ч на 64,8% (отн.) (р = 0,012). При этом содержание ГКК на 6 ч больше на 57,3% (отн.) (р = 0,015), чем на 3 ч (рисунок 7).

 

Рисунок 7. Зависимость содержания ГКК от температуры экстракции.

Figure 7. Dependence of the HCAs content on the extraction temperature.

 

Максимум температурной экстракции приходился на 80ºС, что на 60,1% (отн.) (p = 0,010) больше, чем на кипящей водяной бане; минимум – на комнатную температуру, при которой содержание на 59,7% (отн.) меньше, чем при 40ºС.

Максимальный выход ГКК наблюдали при соотношении сырья и экстрагента – 1 к 25 и 1 к 100 (р = 0,39) – при 1 к 25 экономия экстрагента в 4 раза (рисунок 8); кратности экстракции – однократная (рисунок 9) и размере частиц сырья – 500 мкм (рисунок 10). При однократной экстракции извлекалось в 2,4 раза больше ГКК, чем при двукратной. Содержание ГКК снижалось с увеличением степени измельчения сырья с формированием плато при 1000 и 2000 мкм.

 

Рисунок 8. Зависимость содержания ГКК от соотношения сырья и экстрагента.

Figure 8. Dependence of the HCAs content on the ratio of medicinal plant raw materials and extractant.

 

Рисунок 9. Зависимость содержания ГКК от кратности экстракции.

Figure 9. Dependence of the HCAs content on the extraction rate.

 

Рисунок 10. Зависимость содержания ГКК от размера частиц сырья.

Figure 10. Dependence of the HCAs content on the particle size of the medicinal plant raw material.

 

При проведении дисперсионного анализа влияния условий экстракции на содержание ГКК выявлено, что статистически значимыми факторами экстракции являлись: длительность (р = 0,0053), температура (р = 0,0062), кратность (р = 0,0017) экстракции, соотношение сырья и экстрагента (р = 0,040); статистически не значимы – размер частиц сырья (р = 0,085).

Таким образом, предложена следующая методика экстракции ГКК из одуванчика лекарственного корней. Точную навеску измельченных одуванчика лекарственного корней 500 мкм массой 2 г помещали в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 100 мл и добавляли 20,0 мл воды очищенной; 25,0 мл пропанола-1 и 5,00 мл ацетона. Взвешивали с точностью до 0,01 г, затем нагревали с обратным холодильником при температуре 80ºС в течение 6 ч. Колбу с содержимым охлаждали до комнатной температуры и взвешивали, при необходимости доводили массу пропанолом-1 до первоначальной и перемешивали. Центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 мин. Полученное после центрифугирования извлечение (надосадочную жидкость) использовали для количественного определения.

При воспроизведении условий экстракции, описанных в частных фармакопейных статьях 07/2026:1852 ГФ РБ [4], ЕФ 01/2011:1852 [12] и в статье [13], содержание составило в среднем от 0,3% до 0,55% против 0,7% при подобранных условиях экстракции, которые, в свою очередь, позволяли извлечь больше ГКК в диапазоне: от 30,1% (отн.) (р = 0,026) до 2,5 раза (рисунок 11).

 

Рисунок 11. Содержание ГКК при разных условиях экстракции ГФ РБ – Государственная фармакопея Республики Беларусь; ЕФ – Европейская фармакопея; НЛ – методика экстракции из источника [13]; Р – разработанные условия экстракции.

Figure 11. Content of HCAs under different extraction conditions ГФ РБ – State Pharmacopoeia of the Republic of Belarus; ЕФ – European Pharmacopoeia; НЛ – extraction method from the source [13]; Р – developed extraction conditions.

 

В частной статье ГФ РБ используется двукратная водная экстракция в течение 30 мин на кипящей водяной бане при соотношении сырья и экстрагента 1 к 25 при размере частиц сырья 355 мкм и менее. В частной статье ЕФ проводят водную экстракцию в течение 1 ч при перемешивании при соотношении сырья и экстрагента 1 к 20 при размере частиц 250 мкм и менее. В статье экстракция проводится 50% и 80% этанолом в течение 3 ч при 60ºС с и без добавления 1% раствора муравьиной кислоты.

ВЫВОДЫ

Экспериментально обоснованы условия экстракции, обеспечивающие больший выход ГКК в сравнении с фармакопейными и литературными методиками и включающие использование для извлечения 60% пропанола-1 или смеси из 50% пропанола-1 и 10% ацетона при температуре – 80˚С; длительности – 6 ч; соотношении сырья и экстрагента – 1 к 25; кратности – однократная и размере частиц сырья – 500 и менее.

Диэлектрическая проницаемость, динамическая вязкость, температура кипения, объемные доли метанола, этанола, пропанола-1, пропанола-2, ацетона, ацетонитрила, ДМСО, пропиленгликоля-1,2, этиленгликоля, глицерина в растворах, длительность, температура, кратность экстракции, соотношение сырья и экстрагента статистически значимо влияли на экстракцию ГКК.

Фармакопейные и литературные способы экстракции ГКК из одуванчика лекарственного корней статистически значимо уступали разработанному способу по извлечению целевой группы веществ. Предложенный способ можно рекомендовать для экстракции ГКК с целью обогащения данной группой БАВ получаемых вытяжек.

About the authors

Raman I. Lukashou

Belarusian State Medical University

Author for correspondence.
Email: r_lukashov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5234-6319

PhD, Associate professor, Head of the Pharmaceutical Chemistry Department of with Advanced Training and Retraining Course

Belarus, Minsk

Natalya S. Gurina

Belarusian State Medical University

Email: r_lukashov@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-9150-5728

PhD, Professor, Dean of the Pharmaceutical Faculty

Belarus, Minsk

References

Supplementary files