Antimicrobial activity of fomitoid fungi extracts growing in the territory of the Republic Of Belarus

Full Text

Введение

Фомитоидные трутовики представляют собой группу базидиомицетов, известных своим уникальным химическим составом и широким спектром биологической активности. На территории Республики Беларусь встречается значительное разнообразие таких грибов, включающее виды Ganoderma applanatum, Ganoderma lingzhi, Fomes fomentarius, Fomitopsis pinicola, Laetiporus sulphureus, Phellinus igniarius и Piptoporus betulinus[1, 2]. Эти грибы относятся к ксилотрофным и поражают как живые деревья, выступая как паразитические организмы, так и мертвую древесину, играя важную роль в лесных экосистемах в качестве переработчиков органических веществ. В настоящее время наблюдается заметный интерес к изучению трутовиков в качестве потенциального сырья для получения биологически активных добавок соединений [3, 4].

Фомитоидные трутовики нашли широкое применение в народной медицине благодаря их выраженным целебным свойствам: в традиционных практиках эти грибы использовались для лечения различных заболеваний, включая воспалительные процессы, инфекции, раны, а также для общего укрепления иммунной системы. Современные исследования подтверждают, что экстракты этих грибов обладают антимикробной, противоопухолевой, антиоксидантной, гипогликемической и иммуностимулирующей активностью, что делает их перспективными для дальнейшего изучения [5–9].

Природные источники, такие как растения и грибы, представляют собой ценный ресурс биологически активных веществ, многие из которых обладают уникальными механизмами действия на микроорганизмы [10]. В этом контексте фомитоидные трутовики представляют собой перспективный объект для исследований, направленных на разработку новых природных антимикробных препаратов. Целью настоящей работы является сопоставительный анализ антимикробной активности суммарных и фракционированных экстрактов фомитоидных трутовиков, произрастающих на территории Республики Беларусь, в отношении грамотрицательных, грамположительных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов.

Материалы и методы

Заготовка сырья. Плодовые тела текущего года трутовика березового (Piptoporus betulinus – PB), скошенного (Inonotus obliquus – IO) и настоящего (Fomes fomentarius – FF) были собраны с берёзы повислой, трутовика плоского (Ganoderma applanatum – GA) – с дуба, трутовика ложного (Phellinus igniarius – PI), серно-желтого (Laetiporus sulphureus – LS) и окаймленного (Fomitopsis pinicola – FP) – с сосны, а плодовые тела трутовика лакированного (Ganodermalingzhi – GL) были выращены на субстрате на основе дубовых опилок. Сбор сырья осуществлялся в июле-ноябре 2022 г. в Минской и Гродненской области Республики Беларусь. Сырьё сушили воздушно-теневым методом при температуре 25±2 ℃, предварительно разделив на куски 2-3 см.

Получение экстрактов. Суммарные водно-спиртовые экстракты получали методом ремацерации, используя 70% (об.) этанол и сырье после дробления на молотковой дробилке MOLOT 200 с ситом диаметром отверстий 2 мм. Экстракцию проводили в течение двух недель, обновляя экстрагент каждые 72 часа. Для получения фракционированных экстрактов 50 г измельченного сырья последовательно экстрагировали в аппарате Сокслета, используя петролейный эфир (40–70, х.ч., ЭКОС-1), хлороформ (х.ч., ЭКОС-1), этилацетат (х.ч., ЭКОС-1) и 96% этанол (ректификат). Каждая экстракция длилась 48 часов. Полученные экстракты упаривали под вакуумом (100 мбар) при температуре 40–50 °C с помощью роторного испарителя RV 05 (Ika Werke GmbH) до состояния сухого остатка. Для получения водной фракции оставшийся шрот выдерживали в кипящей воде в течение 2 часов, после чего фильтровали извлечение и упаривали его досуха на водяной бане WB-4 (ОДО «БЕЛАКВИЛОН»).

Готовые экстракты хранили в герметичной таре в морозильной камере при температуре – 18±2 °C. При приготовлении растворов экстрактов пересчет вели на сухое вещество. Потерю в массе при высушивании определяли гравиметрически, высушивая образцы в сушильном шкафу при температуре 105±2 °C до достижения постоянной массы [11].

Определение суммы фенольных соединений. Сумму фенольных соединений (СФ) определяли фотометрически с использованием реактива Фолина-Чокальтеу (Merck, кат. № 109001), используя 1% растворы экстрактов в 70% (об.) этаноле. Для построения калибровочного графика готовили серию растворов галловой кислоты с концентрацией от 15,625 до 500 мкг/мл. В пробирки помещали по 20 мкл растворов экстрактов, 100 мкл реактива Фолина-Чокальтеу (разведение 1:3), 400 мкл 10% раствора Na₂CO₃ (ч.д.а., ЗАО «Пять океанов») и 1500 мкл очищенной воды (полученной с использованием аквадистиллятора ДЭ-10М) и выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 1 часа [12]. Измерение оптической плотности растворов выполняли на спектрофотометре HALO VIS-20 (Dynamica Scientific Ltd.) с использованием кварцевой кюветы (длина оптического пути 1 см) при длине волны 725 нм. СФ выражали в микрограммах на грамм сухого экстракта в пересчете на галловую кислоту.

Определение суммы тритерпеновых и стероидных соединений. Сумму тритерпеновых истероидных соединений (СТС) в образцах полученных экстрактов определяли спектрофотометрическим методом по реакции Либермана-Бурхардта [13]. Для анализа применяли профильтрованные 1% растворы экстрактов в хлороформе. К 1,00 мл хлороформного раствора добавляли 1,00 мл реактива Либермана-Бурхардта (смесь уксусного ангидрида и серной кислоты в соотношении 10:1, об./об., х.ч., Экос-1). Полученную смесь перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 90 минут. После выдержки измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 665 нм. Для построения калибровочного графика использовали серию растворов холестерина в хлороформе с концентрацией от 10 до 1000 мкг/мл (Merck). В качестве контрольного раствора применяли реакционную смесь, не содержащую экстракта. СТС выражали в миллиграммах на грамм сухого экстракта в пересчете на холестерин.

Определение антимикробной активности экстрактов. Антимикробную активность экстрактов определяли с использованием диффузионно-луночного метода [14]. Чашки Петри с мясо-пептонным агаром засевали микроорганизмами сплошным газоном, после чего с помощью стерильного пробойника формировали лунки диаметром 5 мм. В каждую лунку вносили по 50 мкл 1% раствора тестируемого экстракта. В качестве стандартов использовали растворы антибиотиков (ванкомицин, азитромицин и хлорамфеникол) и антифунгального средства (флуконазол) с концентрациями 1 мг/мл. Подготовленные чашки Петри инкубировали в течение 48 часов при температуре 37±1 ℃ в электрическом суховоздушном термостате ТС-1/20.

В качестве тест-микроорганизмов были выбраны грамположительные (Staphylococcus aureus ATCC 15442, Bacillus subtilis ATCC 23857, Enterococcus faecium SF68), грамотрицательные (Escherichia coli ATCC 11229, Pseudomonas aeruginosa ATCC 6538, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Enterobacter cloacaeATCC 13047, Serratia marcescens ATCC 13880, Salmonella thyphimurium ATCC 14028, Salmonella parathyphi A ATCC 9150, Salmonella choleraesuis ATCC 10708, Shigella flexneri ATCC 13047, Proteus vulgaris ATCC 12022) бактерии, дрожжевые (C.albicans ATCC 14053) и плесневые (Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichoderma harzianum ВИЗР-18) грибы. Оценку антимикробной активности проводили по диаметру зоны задержки роста тест-микроорганизма.

Результаты и их обсуждение

Скрининг антимикробной активности суммарных водно-спиртовых экстрактов плодовых тел фомитоидных трутовиков (рисунок 1) показал, что водно-спиртовые экстракты P. betulinus в наибольшей степени ингибируют рост S. aureus, B. subtilis и S. marcescens (в отношении S. aureus и S. marcescens эффект сопоставим с действием антибиотиков). Умеренную активность к S. aureus и Ps. aeruginosa также демонстрируют суммарные экстракты F. pinicola. Кроме того, сдерживать рост S. marcescens оказались способны экстракты F. pinicola, F. fomentarius, G. lingzhi и G. applanatum, а в отношении C. albicans активность продемонстрировали Ph. igniarius, L. sulphureus, F. pinicola, F. fomentarius, а также G. applanatum. Отметим, что рост S. choleraesuis, S. thyphimurium и Kl. pneumoniae слабо ингибировался лишь экстрактом F. fomentarius. Ни один из испытанных объектов не оказал подавляющего действия на рост ни плесневых грибов A. brasiliensis и Tr. harzianum, ни грамотрицательных энтеробактерий E. coli, E. aerogenes, E.cloacae, S. parathyphi A, Sh. flexneri, P. vulgaris.

Рисунок 1. Антимикробная активность суммарных водно-этанольных экстрактов плодовых тел фомитоидных трутовиков

Figure 1. Antimicrobial activity of raw water-ethanol extracts of fruiting bodies of fomitoid tinder fungi

Одним из технологических подходов, позволяющим провести разделение биологически активных веществ из природных объектов является последовательная исчерпывающая экстракция сырья растворителями растущей полярности. В настоящей работе из исследуемого грибного сырья были получены петролейно-эфирные (ПЭ), хлороформные (CHCl₃), этилацетатные (ЭА) и этанольные (96% EtOH) фракции. Путем фитохимического скрининга (рисунок 2) было установлено, что в неполярных (ПЭ и CHCl₃) фракциях преобладают тритерпеновые соединения, наибольшие количества которых содержатся в экстрактах P. betulinus (72,9–99,3 мг/г).

Рисунок 2. Сумма фенольных, сумма тритерпеновых и стероидных соединений экстрактов плодовых тел фомитоидных трутовиков.

Figure 2. Total phenolic content and total triterpene and steroid content of extracts of fruiting bodies of fomitoid tinder fungi.

Рисунок 3. Антимикробная активность фракционированных экстрактов плодовых тел фомитоидных трутовиков.

Figure 3. Antimicrobial activity of fractionated extracts of fomitoid tinder fungi fruiting bodies.

Вместе с тем в полярных спиртовых и водных фракциях содержание тритерпеноидов оказалось минимальным (0,1–9,0 мг/г, рисунок 2). Наибольшее содержание фенольных соединений отмечено в ЭА и этанольных фракциях экстрактов трутовиков (в особенности у Ph. igniariusи F. fomentarius). Водные фракции, в которых преобладают полисахариды и белки, характеризуются низким содержанием как фенолов, так и тритерпеноидов.

Для выделенных фракций экстрактов был проведен последующий скрининг антимикробной активности. В отношении S. aureus, B. subtilis и S. marcescens фракции P.betulinus (рисунок 3), как и его суммарный экстракт (рисунок 1), показали наиболее высокий эффект. В данных, обобщенных на рисунке 3, наблюдается общая закономерность: неполярные фракции (ПЭ, CHCl₃ и ЭА) проявляют наибольшую антимикробную активность (к S. aureus, B. subtilis и S. marcescens), которая коррелирует с содержанием тритерпеновых и стероидных соединений. При этом полярные водные фракции экстрактов трутовиков не продемонстрировали антимикробного эффекта ни к одному тест-штамму. Полученные данные могут свидетельствовать о вкладе липофильных компонентов фомитоидных грибов в их антимикробный эффект.

Заключение

1. Предварительный скрининг антимикробной активности показал, что наибольшую эффективность демонстрируют экстракты P. betulinus, особенно в отношении S.aureus, B. subtilis и S. marcescens, где их действие сопоставимо с антибиотиками. Умеренная активность против S. aureus и Ps. aeruginosa была выявлена у экстрактов F. pinicola.
2. Фракционирование экстрактов по полярности позволило установить, что тритерпеновые соединения в основном содержатся в неполярных фракциях (ПЭ и CHCl₃), причем их наибольшее количество обнаружено в экстрактах P. betulinus, а фенольные соединения преимущественно накапливаются в этилацетатных и спиртовых фракциях, с особенно высоким содержанием в экстрактах Ph. igniarius и F. fomentarius.
3. Показано, что неполярные фракции (ПЭ, CHCl₃ и ЭА) продемонстрировали более высокие уровни антимикробной активности в отношении S. aureus, B. subtilis и S. marcescens.

Полученные данные подчеркивают перспективность изучения липофильных соединений фомитоидных трутовиков как потенциальных источников природных антимикробных средств. Перспективы исследования направлены на выделение и характеристику активных соединений, определение механизма их действия и возможности их применения в медицине.

About the authors

Hleb Harbatsevich

Author for correspondence.
Email: hleb.harbatsevich@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-0226-8636

PhD in Chemistry, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Pharmaceutical Chemistry with a course of advanced training and retraining

References

Supplementary files