Antipyretic and antimicrobial activity of blackberry leaves (Rubus caesius L.)

Full Text

Лихорадка (жар) является одним из признаков воспалительного процесса в организме. Она направлена на удаление или уничтожение пирогенного фактора из организма. Лихорадка развивается за счет каскада патофизиологических процессов, одним из которых является - повышение установочной точки терморегуляции в гипоталамусе, который отвечает за терморегуляцию тела человека. Повышение температуры тела имеет положительные эффекты: препятствует размножению микроорганизмов, снижает их устойчивость к лекарственным препаратам, увеличивает скорость метаболических реакций, а также усиливает иммунную реакцию организма (повышение синтеза интерферонов, стимуляция Th1-ответа, увеличение продукции IgG, клеток памяти, стимуляция перехода иммунного ответа от Th2 к более специфическому Th1), увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера [1].

При этом лихорадка имеет и отрицательное действие на организм человека: увеличение частоты дыхания, частоты сердечных сокращений, уменьшение периферического кровообращения (бледность кожных покровов, “гусиная”, мраморная кожа), потеря жидкости за счет частого дыхания, снижение секреции пищеварительных желез, потеря аппетита, атония, запор, гипогликемия, ацидоз, отрицательный азотистый баланс и др. Кроме этого лихорадка сопровождается дрожью (сократительный термогенез), повышенным напряжением мышц и как следствие боль в них [1].

Cогласно протоколам оказания медицинской помощи в Республике Беларусь применение жаропонижающих препаратов рекомендовано при повышении температуры тела взрослого и ребенка свыше 38℃/38,5℃ и плохом самочувствии пациента. В качестве жаропонижающих препаратов при этом применяются метамизол натрия, парацетамол, ибупрофен, диклофенак, кеторолак [2-4].

Данные препараты оказывают свое действие на лихорадку за счет угнетения или полного подавления ферментов циклооксигеназы (ЦОГ1, ЦОГ2). Данный фермент отвечает за выработку простагландинов, которые в свою очередь провоцируют воспалительную реакцию и лихорадку. Однако нестероидые противовоспалительные препараты, которые применяются в качестве жаропонижающих средств имеют ряд побочных эффектов: повреждающее действие на слизистые оболочки желудка и 12-перстной кишку (воспаление, язвы, кровотечения), тромбообразование (инфаркты, инсульты), токсическое действие на почки, печень и др [5, 6].

Растительное сырье и лекарственные средства растительного происхождения также применяется как в народной медицине, так и в официнальной для снижения температуры при лихорадке (лабазника трава, ивы белой кора, липы цветки, малины обыкновенной плоды, листья и побеги) [7]. В Республике Беларусь зарегистрирован лекарственный препарат растительного происхождения (ЛПРП) “Инсти” (Herbion, Пакистан), который применяется в составе комплексного лечения острых респираторных заболеваний, сопровождающиеся повышением температуры тела до 38℃. Однако отечественные производители на данный момент выпускают только одно наименование ЛПРП для снижения температуры - лабазника вязолистного траву (ООО “Калина”, РБ) [8], что обусловливает поиск растений и растительного сырья, обладающих жаропонижающими свойствами и разработку лекарственных препаратов на основе его.

В свою очередь, микроорганизмы и их компоненты, попадая во внутреннюю среду организма человека, распознаются иммунной системой, что приводит к выработке эндогенных пирогенов и лихорадке [9].

Актуальным является поиск и изучение новых природных соединений, обладающих жаропонижающей и антимикробной активностью. Растения за счет содержания комплекса биологически активных веществ могут рассматриваться как перспективный объект, обладающий поливалентным действием.

Таким образом целью нашей работы стало изучение жаропонижающей и антимикробной активности листьев ежевики сизой в доклинических исследованиях.

Материалы и методы.

Жаропонижающая активность. Для моделирования лихорадки в доклинических исследованиях используют дрожжевую, пирогеналовую, молочную, формалиновую модели [10-13].

Нами была выбрана пирогеналовая модель лихорадки для выявления жаропонижающих свойств листьев ежевики сизой.

В эксперименте участвовало 24 животных (крысы линии Wistar) массой 200-250 грамм, которые были разделения на 3 группы по 8 животных:

группа К (контрольная группа) – получала внутрижелудочно воду очищенную, 2,5 мл;

группа Е (экспериментальная группа) – получала водное извлечение из листьев ежевики сизой (ИЛЕС), 500 мг/кг;

группа А (экспериментальная группа) – получала внутрижелудочно ацетилсалициловую кислоту (АСК), 200 мг/кг.

Водное извлечение готовили из высушенного в естественных условиях (комнатная температура и отсутствие прямых солнечных лучей) сырья, заготовленного в Минской области (поселок Новоколосово) в июне 2024 года.

Настой из листьев ежевики сизой получали в соответствии с требованиями фармакопейной статьи “Настои, отвары и чаи” [14], помещали настой в сушильный шкаф (t= 60 ℃) до высыхания, сухой экстракт взвешивали на аналитических весах и растворяли в воде очищенной.

Во время проведения эксперимента животные находились в клетке по 4 животных. В комнатах проводился контроль состояния окружающей среды: температура воздуха 28-30℃, относительная влажность воздуха от 30 % до 80 %. Животных размещали в помещении с температурой от 28℃ до 30℃ за 2 суток до эксперимента, для адаптации и снижения влияния окружающей температуры на метаболизм и температуру тела животного [15]. Схема/протокол исследования приведен в таблице 1.

Таблица 1 – Схема проведения эксперимента по оценке жаропонижающей активности листьев ежевики сизой.

Table 1 – Scheme of the experiment to evaluate the antipyretic activity of dewberry leaves.

 

	День 1-2	День 3			День 4 (8.30)
		8.00	8.30	9.30-14.30 (ежечасно)
группа К	введение воды очищенной внутрижелу-дочно, 2 мл	введение воды очищенной внутрижелу-дочно, 2 мл	введение пирогенала внутривенно в хвостовую вену, 50 мкг/кг (500 МПД)	измерение температуры тела у животных	измерение температуры тела у животных
группа Е	введение внутрижелу-дочно ИЛЕС, 500 мг/кг	введение внутрижелу-дочно ИЛЕС, 500 мг/кг
группа А		введение внутрижелу-дочно АСК, 200 мг/кг

 

Внутрижелудочно жидкости вводили металлическим зондом с оливой на конце, измерение температуры проводили ректально цифровым термометром Omron Flex Temp Smart (MC-343F-RU, Omron Healthcare Co, Ltd, Япония).

Исследование проводилось в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей, с соблюдением правовых и этических норм в отношении экспериментальных животных [16]. Проведение экспериментального исследования было одобрено этическим комитетом учреждения образования “Белорусский государственный медицинский университет” протокол №6 от 20.03.2024 г.

Антимикробная активность. Для получения экстрактов использовали 2 серии растительного сырья: заготовленное в Брестской области, агрогородок Черни (серия Б) и Минской области, поселок Новоколосово (серия М) в июне 2023 года. Сушка сырья проводилась воздушно-теневым методом: при комнатной температуре без доступа прямых солнечных лучей.

Для получения экстрактов сырье предварительно измельчали и просеивали (частицы, проходящие сквозь сито 2000, что соответствует размеру частиц 2 мм).

Настои из двух серий сырья (Б и М) готовили в соответствии с требованиями ГФ РБ [14]: навеску сырья помещали в колбу со шлифом и заливали водой очищенной в соотношении 1:10 (с учетом коэффициента водопоглощения). К колбе присоединяли обратный холодильник и помещали ее на кипящую водяную баню. Экстракцию при нагревании проводили в течение 15 минут. После чего колбу доставали и оставляли на 45 минут для охлаждения. Далее настой фильтровали, сырье отжимали и выбрасывали.

Получение настойки (Б и М): измельченное сырье помещали во флакон из темного стекла и заливали спиртом этиловым 60 % (соотношение 1:10 с учетом коэффициента поглощения спирта). Флакон помещали в темное место при комнатной температуре на 7 дней (суток), ежедневно осуществляли перемешивание в течение 15 минут. По истечении 7 дней (суток) настойку фильтровали, сырье отжимали и выбрасывали.

Для проведения исследования использовали чистые культуры бактерий E. coli (АТСС 25922), P. aeruginosa (АТСС 27853), S. aureus (АТСС 25923), B. subtilis (ATCC 6633), выращенные в течение 24 часов на скошенном ТСА при температуре 35±2°С и культуру C. albicans (АТСС 10231), выращенную в течение 24 часов на скошенном агаре Сабуро при температуре 20±2°С. Суспензии тест-культур готовили смыванием стерильным физиологическим раствором с последующей стандартизацией по Мак Фарланд до 1,0x10⁶ КОЕ/мл.

В качестве питательной среды для бактерий использовали ТСА, для C. albicans использовали агар Сабуро. В чашки Петри заливали растопленный агар равномерным слоем (около 5 мм толщиной) и давали остыть, высохнуть. После чего на агар помещали 0,5 мл взвеси микроорганизмов и распределяли равномерно по всей поверхности стерильным шпателем и оставляли на 5-7 минут. Затем на равном расстоянии друг от друга в агаре пробивали 5 лунок диаметром 5 мм. В четыре лунки помещали по 75 мкл экстракта, в одну – 75 мкл контрольного раствора. В качестве контрольного раствора в испытании с настоями использовалась вода очищенная, в испытании с настойками - спирт этиловый 60 %. Чашки с ТСА инкубировали при температуре 35±2°С, чашки с агаром Сабуро – при температуре 20±2°С в течение 24 часов. Учет результатов проводили путем измерения диаметра зон задержки роста микроорганизмов вокруг лунок с экстрактами и контрольными растворами [17].

Проводили статистическую обработку результатов с помощью Microsoft Excel 2016 и программного обеспечения Statistica 10.0 (Stat soft, США).

Для оценки отличий между группами в эксперименте пирогеналовой лихорадки использовали метод Краскелла-Уоллиса (сравнение трех независимых групп), для выявления различий между контрольными и экспериментальными группами применяли метод Манна-Уитни (попарное сравнение двух независимых групп). Различия в показателях температуры тела между группами считали значимыми при p<0,05.

Для сравнения значений диаметра зон задержки роста микроорганизмов в контрольных лунках и лунках с исследуемыми экстрактами использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты

Значения температуры тела животных в группах до и после введения пирогенала представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Температура животных в эксперименте пирогеналовой лихорадки

Table 2 – Temperature of animals during pyrogenal fever experiment

 

время измерения температу-ры	группа К	группа Е	группа А	Краскелла-Уоллиса (H, p)	Манна-Уитни (группа К-группа Е) (Z, p)	Манна-Уитни (группа А-группа Е) (Z, p)
8.00	37,45±0,39	37,73±0,32	37,66±0,32	H (2, N=24) = 2,386578; p=0,3032	Z=-1,3754; p=0,1690	Z=-0,317; p=0,7512
9.30	38,49±0,36	38,15±0,63	38,38±0,37	H (2, N=24) = 1,184347; p=0,5531	Z=1,0044; p=0,3152	Z=0,4779; p=0,6327
10.30	39,18±0,46	38,53±0,55	38,65±0,60	H (2, N=24) = 5,702146; p=0,0578	Z=2,2103; p=0,0271	Z=0,4235; p=0,6719
11.30	39,09±0,30	38,41±0,67	38,44±0,52	H (2, N=24) = 7,846302; p=0,0198	Z=2,0693; p=0,0385	Z=1056; p=0,9159
12.30	39,14±0,15	38,31±0,62	38,38±0,65	H (2, N=24) = 10,84694; p=0,0044	Z=2,6430; p=0,0082	Z=0,0528; p=0,9579
13.30	39,16±0,25	38,45±0,89	38,35±0,67	H (2, N=24) = 6,825295; p=0,0330	Z=1,5307; p=0,1258	Z=-0,5810; p=0,5612
14.30	39,06±0,43	38,31±0,52	38,3±0,77	H (2, N=24) = 7,356433; p=0,0253	Z=2,4735; p=0,0134	Z=0,1054; p=0,9161
8.30	37,91±0,37	37,5±0,30	37,99±0,44	H (2, N=24) = 6,765528; p=0,0340	Z=1,9632; p=0,0496	Z=2,3276; p=0,0199

* значения температуры в таблице приведены в виде M±SD.

Во всех исследуемых группах наблюдался подъем температуры тела животных после введения пирогенала. В контрольной группе разница температуры по сравнению с начальной точкой эксперимента (до введения пирогенала) составила от 0,97 ℃ до 1,75 ℃, в группе Е – от 0,42 ℃ до 0,8 ℃, в группе А – от 0,64 ℃ до 0,99 ℃.

В контрольной группе, не получавшей лечение, подъем температуры оказался максимальным в эксперименте. Пик лихорадочной реакции после введения пирогена наблюдали на втором часу.

Температура тела в экспериментальной группе, получавшей водное извлечение из листьев ежевики сизой, статистически значимо отличалась от температуры тела животных, не получавших лечение (p<0,05). За исключением 5 часа измерения температуры после введения пирогенала, где разница статистически недостоверна, но в группе Е при этом она на 0,71 ℃ ниже, чем в группе К.

Статистически значимых отличий между температурами тела между группами животных Е и А в процессе эксперимента не наблюдалось (кроме значений температуры тела через сутки после введения пирогенала) (p>0,05).

Жаропонижающий эффект водного ИЛЕС в дозе 500 мг/кг, сопоставим с жаропонижающим эффектом ацетилсалициловой кислоты в дозе 200 мг/кг в эксперименте.

Вокруг лунок с настоями из листьев ежевики сизой на всех чашках были зафиксированы зоны задержки роста, вокруг контрольных лунок, куда вносили воду очищенную, наблюдали сплошной рост микроорганизмов. Оценивая среднее значение диаметра зоны задержки роста на чашках с различными микроорганизмами следует отметить, что наибольшим оно было на чашках с B.subtilis (12,50±0,49 мм для настоя Б и М), наименьшим – с  E. coli ( 9,25±0,81 мм и 10,25±0,42 соответственно). На чашках со S. aureus средний диаметр зоны задержки роста был 11,50±1,47 мм (настой Б), 10,50±2,02 мм (настой М), на чашках с P.aueruginosa – 10,00±0,69 мм и 10,50±0,49 мм соответственно. Данные показатели достоверно отличаются от контроля, что свидетельствует об антибактериальной активности обоих настоев в отношении исследуемых бактерий (коэффициент Стьюдента; p<0,05).

Настойки из листьев ежевики сизой подавляли рост всех штаммов микроорганизмов в эксперименте. Максимальная антимикробная активность настоек проявлялась в отношении синегнойной палочки (13,5±0,49 мм для настойки Б, 11,00±0,98 мм для настойки М), минимальная – в отношении кишечной палочки (10,5±0,49 мм и 10,25±0,42 мм соответственно). Во всех контрольных лунках, куда помещали спирт этиловый 60 %, используемый в качестве контроля, наблюдались также зоны задержки роста от 5,5 мм до 8 мм. Зоны задержки роста настоек достоверно отличаются от зоны задержки роста в контрольной лунке (коэффициент Стьюдента; p<0,05), что свидетельствует об антибактериальной активности биологически активных веществ листьев ежевики сизой в настойке.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                              

В нашем эксперименте настой Б и настойки Б, М из листьев ежевики сизой подавляли рост C.albicans. Средний диаметр зоны задержки роста для настоя составила 14,00±0,80 мм (t=22,86, p=0,000022), для настойки Б – 12,25±1,47 мм (t=4,88, p=0,008164), настойки М – 11,50±1,77 мм (t=3,28, p=0,030513). Спирт этиловый также задерживал рост C.albicans (зона задержки роста - 6 мм). Вода очищенная в контрольной лунке не задерживала рост кандиды (наблюдался сплошной рост вокруг лунки).

Обсуждение

Снижение температуры тела животных в группе Е может быть связано с наличием в водном извлечении флавоноидов и салицилатов, которые извлекаются из листьев ежевики сизой. Салицилаты блокируют циклооксигеназы и таким образом останавливают развитие лихорадочной реакции. Флавоноиды могут оказывать терморегулирующее действие за счет сосудорасширяющего действия. В периферических сосудах увеличивается кровенаполняемость и тем самым увеличивается теплоотдача. Доказано противовоспалительное действие флавоноидов, в том числе и посредством ингибирования ферментов в каскаде превращения арахидоновой Флавоноиды тормозят окисление арахидоновой кислоты за счет связывания с циклооксигеназой и липооксигеназой различных клеток организма человека. (тромбоцитов, лейкоцитов и др.) [18, 19].

Антимикробное действие экстрактов на основе листьев ежевики сизой можно связать с наличием в них флавоноидов и дубильных веществ. Флавоноиды могут оказывать блокирующее действие на различные ферменты бактерий (ДНК-гиразы, топоизомеразы I и II), а также оказывать повреждающее действие на клеточную мембрану и стенку микроорганизмов (блокада синтеза жирных кислот, ингибирование синтеза мембранных липидов и др.) [20].

В эксперименте зона задержки роста микроорганизмов S.aureus и B.subtilts в случае воздействия  настоя оказалась больше, чем при воздействии настойки. Это может быть связано с качественными и количественными различиями в составе экстрактов. Водный настой содержит в большем количестве дубильные вещества, так как они хорошо экстрагируются полярными растворителями. Дубильные вещества способны связываться с белками различной природы [21], в том числе пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий, что приводит к нарушению проницаемости клеточной стенки бактерий и приводит к их гибели.

Заключение

Впервые экспериментально доказано на модели пирогеналовой лихорадки жаропонижающее действие листьев ежевики сизой. Введение водного извлечения листьев ежевики сизой в дозе 500 мг/кг оказывает жаропонижающий эффект, сопоставимый с жаропонижающим эффектом ацетилсалициловой кислоты в дозе 200 мг/кг.

Установлен спектр антимикробного действия водных и спиртовых извлечений из листьев ежевики сизой в отношении грамотрицательных (E.coli, P.aeruginosa), грамположительных (B.subtilis, S.aureus) бактерий и гриба C.albicans.      Полученные результаты определяют возможность применения листьев ежевики сизой при патологиях, вызванных данными микроорганизмами, сопровождающимися повышением температуры.

About the authors

Alena Kasianiuk

Belarusian State Medical University

Author for correspondence.
Email: helenakushner@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-8482-318X

senior lecturer of the Department of Pharmacy Organization with Advanced Training and Retraining Course

Belarus, 220083, Republic of Belarus, Minsk, 83 Dzerzhinsky Ave

Tatiana Adamovich

Белорусский государственный медицинский университет

Email: 375257385159@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-1239-3573

кандидат медицинских наук, доцент, кафедра микробиологии, иммунологии и вирусологии

Belarus

Volha Mushkina

Белорусский государственный медицинский университет

Email: olga7081@tut.by

кандидат фармацевтических наук, заведующий кафедрой, кафедра организации фармации с курсом повышения квалификации и переподготовки

Belarus

References

Supplementary files