A comparative evaluation of the antimicrobial activity of aqueous extracts from aerial organs of meadowsweet (Filipendula Ulmaria (L.) Maxim.) and dropwort (Filipendula Hexapetala Gilib.)

Full Text

Список сокращений

ТСХ – тонкослойная хроматография; СО – стандартный образец; ДСК – диазобензосульфокислота; МПК – минимальная подавляющая концентрация.

АКТУАЛЬНОСТЬ

Лабазник вязолистный (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.) и лабазник шестилепестный (Filipendula hexapetala Gilib.) – растения, относящиеся к семейству Розоцветные (Rosaceae), широко распространены в степной и лесостепной зонах европейской час-ти России, особенно в Приволжском федеральном округе [1].

Оба вида исследуемых лабазников имеют богатый химический состав, характеризуются разнообразным составом биологически активных веществ, представленным в основном фенольными соединениями, которые обладают противомикробным действием. Так, в подземной части лабазника вязолистного и шестилепестного содержатся фенольные соединения, представленные салициловым альдегидом, фенологликозидами, дубильными веществами, флавоноидами [2]. Листья лабазника вязолистного содержат фенолкарбоновые кислоты и их производные (кофейную и эллаговую кислоты), дубильные вещества, катехины, флавоноиды, стебли содержат дубильные вещества и следы флавоноидов [2]. В цветках лабазника вязолистного обнаружено эфирное масло, ароматические соединения: метилсалицилат, салициловый альдегид, а также флавоноиды [2]. В состав плодов лабазника вязолистного и шестилепестного входят дубильные вещества и флавоноиды [2].

Ранее рядом ученых был проявлен интерес к антимикробной активности подземных и надземных органов растений рода лабазник [3–7]. В отношении штамма Bacillus polymixa, Bacillus subtilis, Sarcina lutea выявлена антимикробная активность водных экстрактов из соцветий лабазника вязолистного [3]. Учеными из Белоруссии было установлено, что увеличение влажности хранящегося сырья, а именно цветков лабазника вязолистного, приводило к снижению антимикробной активности самого сырья [5]. Учеными из России была изучена антимикробная активность водных и водно-спиртовых (на 40%-ном и 70%-ном спирте этиловом) извлечений из плодов, цветков и травы лабазника вязолистного и шестилепестного [8–10].

Однако в настоящее время препараты на основе сырья лабазника на российском фармацевтическом рынке отсутствуют.

ЦЕЛЬ

Определение сравнительной антимикробной активности водных извлечений из надземных органов лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектами исследования являлись водные извлечения из надземных органов лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного. Для приготовления извлечений использовали сырье лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного, заготовленное в 2021 году в поселке Алексеевка Самарской области.

Для проведения фитохимического анализа надземной части лабазника вязолистного и шестилепестного использовался метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), который проводился в соответствии с ОФС.1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография» ГФ РФ XIV изд. [11]. Анализ ТСХ осуществляли с использованием хроматографических пластинок «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», микропипеткой наносили 0,02 мл извлечений (использовались водные извлечения, извлечения на 40%-ном и 70%-ном спирте этиловом и хлороформные извлечения). Рядом микропипеткой наносили раствор свидетеля – стандартный образец (СО) рутина, который соответствовал требованиям ГФ РФ XIV изд. и был предоставлен для исследования центром коллективного пользования Института фармации Самарского государственного медицинского университета. Определение проводили в системе хлороформ – этанол – вода (25:18:2). Полученные хроматограммы просматривали в УФ-свете при λ=254 нм и λ=365 нм, а также обрабатывали раствором диазобензосульфокислоты (ДСК) в 20% растворе натрия карбоната.

Для проведения эксперимента в отношении антимикробной активности получали настои (1:10) листа, стебля, комплекса «стебель и лист», а также комплекса «стебель, лист и цветок» лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного. Настои готовили в соотношении 1:10 по методике, изложенной в Государственной фармакопее РФ XIV издания [11]. Антимикробную активность водных извлечений сырья лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного определяли методом двойных серийных разведений в бульоне Мюллера – Хинтона в соответствии с ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам» [12].

Антибактериальное действие исследовали по отношению к грамположительным (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ATCC 29213) и грамотрицательным (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) бактериям.

Для проведения исследования использовали микрометод, тестирование проводили при величине конечного объема 100 мкл. Рабочие растворы вносили в планшеты для микроразведений по 50 мкл на лунку. При помощи многоканальных пипеток 96-луночный стерильный планшет для иммунологических исследований (с плоским дном) с крышкой заполняли двойными серийными разведениями исследуемых извлечений. Затем разведения инокулировали приготовленной суспензией исследуемого микроорганизма. Инкубацию проводили в обычной атмосфере при температуре 35 ºС. При проведении инкубации планшет закрывали крышкой для предотвращения высыхания содержимого лунок.

Инокулюм готовили путем суспензирования колоний, отобранных из ночной культуры, выросшей на 5% кровяном агаре (HiMedia, Индия). Окончательная микробная нагрузка в инокулюме составляла 5×105 КОЕ/мл. Для приготовления инокулюма с необходимой концентрацией микроорганизмов использовали 100 мкл суспензии, эквивалентной 0,5 стандарта МакФарланда, которую переносили в пробирку, содержащую 9,9 мл (разведение 1:100) бульона, что позволяло получить суспензию с концентрацией клеток 1х106 КОЕ/мл, при добавлении 50 мкл которой к равному объему (50 мкл) исследуемого раствора получали окончательный состав инокулюма. Инокулюм вносился в пробирки с разведениями образца не позднее 15 мин с момента его приготовления. Планшеты с тестируемыми штаммами инкубировали при температуре 35 °С в течение 20–24 ч.

Для определения наличия роста микроорганизма лунки планшетов с посевами просматривали в проходящем свете. Рост культуры в присутствии тестируемого образца наблюдали при сравнении с лункой «отрицательного» контроля. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли по наименьшей концентрации тестируемого образца, которая подавляет видимый рост микроорганизма [12].

Оценку результатов проводили визуально по наличию / отсутствию роста микроорганизмов в лунках стерильного планшета для иммунологических исследований с соответствующими разведениями исследуемых образцов [13]. Минимальной ингибирующей концентрацией являлась самая низкая концентрация изучаемого образца, которая полностью подавляла рост штамма микроорганизмов.

Препаратами сравнения служили несколько лекарственных субстанций с доказанной антимикробной активностью: 0,1% раствор левомицетина спиртовой (ОАО «Синтез» (Россия), серия 160421) и свежеприготовленный 0,1% раствор бензилпенициллина (ОАО Биосинтез (Россия), серия 0906321).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фитохимический анализ, проведенный методом ТСХ, определил при детекции в УФ-свете с λ = 366 нм ярко выраженные розовые флуоресценции пятен хлорофилла с подвижностью Rf ≈ 0,70 хлороформных извлечений исследуемых образцов. В водно-спиртовых извлечениях тоже, только менее интенсивно, наблюдалось проявление хлорофилла в извлечениях 70%-ным спиртом этиловым. Темно-фиолетовая флуоресценция и сине-фиолетовое свечение в УФ-свете при длине волны 254 нм говорят о содержании в сырье веществ фенольной природы. Установлено наличие в сырье двух видов лабазника соединений фенольной природы, предположительно флавоноидов, которые обнаруживаются по характерному желтому окрашиванию пятен после обработки раствором ДСК в 20% растворе натрия карбоната, Rf которых соответствует Rf СО рутина, взятого в качестве образца сравнения.

По результатам проведенных микробиологических исследований установлено, что все анализируемые водные извлечения из различных органов надземной части лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного оказывают антимикробное действие в отношении тестируемых бактерий.

Водные извлечения из различных органов надземной части лабазника вязолистного проявляют значительную противомикробную активность в отношении грамположительных бактерий. Так, настой из стебля лабазника вязолистного остается активным в отношении против бактерии штамма S. aureus при трехкратном разведении. Остальные водные извлечения из надземных органов лабазника вязолистного проявляют активность в отношении против бактерии штамма S. aureus до двукратного разведения, после наблюдается рост тестируемого микроорганизма (таблица 1).

 

Таблица 1. Результаты тестирования извлечений из надземной части лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.))

Table 1. The test results for the extracts from the aerial part of the meadowsweet (Filipendula ulmaria (L.))

Объект / Микроорганизм	Кратность разведения*
	1	2	3	4	5	6	7
	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Pseudomonas aeruginosa
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	+	+	+	+	+	+	+
Staphylococcus aureus
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	–	–	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	–	–	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	–	–	–	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	–	–	+	+	+	+	+
Escherichia coli
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	+	+	+	+	+	+	+
Bacillus cereus
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	–	–	–	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	–	–	–	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	–	–	–	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	–	–	–	–	+	+	+

Примечание: + наличие роста микроорганизма; – отсутствие роста микроорганизма.

 

Данные показатели активности настоев сопоставимы с действием образца сравнения – свежеприготовленного 0,1% раствора бензилпенициллина. Препарат оказывал противомикробное действие в отношении грамположительной бактерии штамма S. aureus до двукратного разведения (таблица 3).

Настой, изготовленный из комплекса органов надземной части (цветок, лист, стебель) лабазника вязолистного, проявлял максимальную антимикробную активность в отношении грамположительной бактерии штамма B. cereus (оставался активным при четырехкратном разведении). Остальные водные извлечения из надземных органов лабазника вязолистного проявляли свою активность в отношении бактерии штамма B. cereus до трехкратного разведения (таблица 1).

Оба препарата сравнения в отношении грамположительной бактерии штамма B. cereus оставались активными до четырехкратного разведения.

Данный факт говорит о том, что в настоях содержится комплекс биологически активных соединений, способный проявлять фармакологический эффект, сопоставимый с действием образцов сравнения.

В отношении грамотрицательных бактерий штаммов P. aeruginosa и E. coli настои, изготовленные из различных органов надземной части лабазника вязолистного, антимикробную активность не проявляли (таблица 1).

Водные извлечения из различных органов надземной части лабазника шестилепестного менее активны в отношении тестируемых бактерий по сравнению с водными извлечениями из различных органов надземной части лабазника вязолистного. Максимальную антимикробную активность проявлял настой из комплекса органов надземной части (цветок, лист, стебель). Этот настой проявлял максимальную антимикробную активность в отношении бактерии штамма S. aureus (оставался активным при двукратном разведении) и в отношении бактерии штамма B. cereus (оставался активным при трехкратном разведении) (таблица 2).

 

Таблица 2. Результаты тестирования извлечений из надземной части лабазника шестилепестного (Filipendula hexapetala Gilib.)

Table 2. The test results for the extracts from the aerial part of the dropwort (Filipendula hexapetala Gilib.)

Объект / Микроорганизм	Кратность разведения*
	1	2	3	4	5	6	7
	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Pseudomonas aeruginosa
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	–	–	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	–	+	+	+	+	+	+
Staphylococcus aureus
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	–	–	+	+	+	+	+
Escherichia coli
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	+	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	–	+	+	+	+	+	+
Bacillus cereus
Водное извлечение (1:10) из листа и стебля	–	–	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из стебля	–	+	+	+	+	+	+
Водное извлечение (1:10) из листа, стебля и цветка	–	–	–	+	+	+	+

Примечание: + наличие роста микроорганизма; – отсутствие роста микроорганизма.

 

Данные показатели настоев сопоставимы с действием образца сравнения – свежеприготовленного 0,1% раствора бензилпенициллина (таблица 3).

 

Таблица 3. Результаты тестирования антибактериальной активности образцов сравнения

Table 3. The results of testing of the reference samples for the antibacterial activity

Объект/ Микроорганизм	Кратность разведения*
	1	2	3	4	5	6	7
	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Pseudomonas aeruginosa
0,1% раствор левомицетина спиртовой	–	–	–	–	+	+	+
0,1% раствор бензилпенициллина	+	+	+	+	+	+	+
Staphylococcus aureus
0,1% раствор левомицетина спиртовой	–	–	–	–	+	+	+
0,1% раствор бензилпенициллина	–	–	+	+	+	+	+
Escherichia coli
0,1% раствор левомицетина спиртовой	–	–	–	–	–	–	+
0,1% раствор бензилпенициллина	–	–	–	–	+	+	+
Bacillus cereus
0,1% раствор левомицетина спиртовой	–	–	–	–	+	+	+
0,1% раствор бензилпенициллина	–	–	–	–	+	+	+

Примечание: + наличие роста микроорганизма; – отсутствие роста микроорганизма.

 

Исследования антибактериальной активности образцов сравнения (0,1% раствор левомицетина спиртовой и свежеприготовленный 0,1% раствор бензилпенициллина) показали, что препараты проявляют свою естественную противомикробную активность в отношении исследуемых штаммов.

Таким образом, проведенные исследования извлечений из надземных органов двух видов лабазника выявили их существенную антимикробную активность. Проведенные фитохимические исследования позволили выявить схожесть хроматографических профилей в сырье двух видов изучаемых лабазников, а также наличие в них веществ фенольной природы, предположительно флавоноидов, представленных рутином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе хроматографических исследований в траве двух видов лабазника выявлены вещества фенольной (флавоноиды, простые фенолы) природы.

Проведено скрининговое исследование антибактериальной активности водных извлечений из надземных органов лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного в отношении 4 штаммов микроорганизмов. Выявлено, что наибольшей антибактериальной активностью водные извлечения обладают в отношении грамположительных бактерий штаммов S. aureus и B. cereus. Полученные настои не уступают в антимикробной активности субстанциям, служившим образцами сравнения (0,1% раствор левомицетина спиртовой и свежеприготовленный 0,1% раствор бензилпенициллина). Так, настой лабазника вязолистного, содержащий в своем составе комплекс «цветок – лист – стебель», остается активным при четырехкратном разведении в отношении грамположительной бактерии штамма B. сereus. Настой лабазника шестилепестного, содержащий комплекс аналогичного состава, активен до трехкратного разведения. Субстанции (0,1% раствор левомицетина спиртовой и свежеприготовленный 0,1% раствор бензилпенициллина), служившие в качестве образцов сравнения, оставались активны до четырехкратного разведения в отношении грамположительной бактерии штамма B. cereus.

Представленные результаты позволяют сделать вывод о том, что антибактериальное действие изготовленных водных растительных извлечений сходно с действием препаратов с доказанной антимикробной активностью. Наиболее существенным антимикробным действием обладают настои, содержащие в своем составе комплекс из надземных органов («цветок – лист – стебель»).

Полученные данные позволяют сделать вывод о сходной фармакологической активности исследуемых видов и подтверждают перспективность дальнейшего исследования надземной части лабазника вязолистного и лабазника шестилепестного в качестве возможного источника биологически активных веществ с антимикробным действием.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Nikita S. Sokolov

Samara State Medical University

Email: nikich15@icloud.com
ORCID iD: 0000-0001-8138-4306

Postgraduate Student of the Department of Chemistry of the Institute of Pharmacy

Russian Federation, Samara

Safia Kh. Sharipova

Samara State Medical University

Email: s.h.sharipova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-6532-4749

PhD, Associate Professor, Department of Chemistry of the Institute of Pharmacy

Russian Federation, Samara

Ksenia N. Sazanova

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: kse-sazanova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4287-8386

PhD, Assistant of the Department of Management and Economics of Pharmacy

Russian Federation, Samara

Artem V. Lyamin

Samara State Medical University

Email: avlyamin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-5905-1895

PhD, Associate Professor, Department of General and Clinical Microbiology, Immunology and Allergology

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files