Gene expression of the congenital immunity in tissues of the placenta and fetal membranes in full-term pregnancy

Full Text

Нарушение иммунной функции плаценты лежит в основе большинства акушерских осложнений и «больших» акушерских синдромов [10]. Само по себе возникновение, прогрессирование беременности и ее окончание, то есть рождение ребенка, связано с каскадом не только гормон-опосредованных изменений, но и, в первую очередь, иммунологических реакций. Соответственно, актуальным стало исследование особенности экспрессии генов врожденного иммунитета в норме и при патологии в различные сроки беременности.

Одни из наиболее важных рецепторов врожденного иммунитета — Toll-подобные рецепторы (TLRs). Они относятся к семейству паттерн-распознающих рецепторов (PRRs) и осуществляют распознавание молекулярных структур различных микроорганизмов, обеспечивая быструю реакцию клетки. Несмотря на то что у ряда организмов идентифицированы функциональные TLR, их биологическая роль и механизмы функционирования до конца не изучены. У человека выделено 10 TLR [4, 23].

В зависимости от локализации TLRs условно разделены на две подгруппы: TLRs, которые локализуются на цитоплазматической мембране клетки (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10), и TLRs, которые локализуются и проявляют свою активность на мембранах внутриклеточных везикул, таких как лизосомы, эндосомы, эндоплазматический ретикулум (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) [4]. TLR2, TLR4 и TLR6 функционируют в качестве основных врожденных датчиков у млекопитающих для распознавания клеточной стенки компонентов грамотрицательных бактерий. Внутриклеточные TLR3 распознают вирусную двухцепочечную РНК, а TLR7, TLR8, TLR9 — нуклеиновые кислоты. Рецепторы клеточной мембраны, такие как TLR4, связывают эндотоксин (липополисахарид) грамотрицательных бактерий, активация которого сопровождается экспрессией генов цитокинов и других сигнальных пептидов, что позволяет выделить его ключевую роль в реализации реакций врожденного иммунитета; TLR5 распознает бактериальные белки жгутиков; рецептор TLR2 уникален своей способностью образовывать гетеродимеры с TLR1 и TLR6 на поверхности цитоплазматической мембраны. Большинство TLRs экспрессируются иммунными клетками — макрофагами, моноцитами, нейтрофилами, лейкоцитами, тучными и дендритными клетками, которыми богата плацента. Кроме того, TLRs также играют ключевую роль в патогенезе асептического воспаления, посредством активации через эндогенные лиганды, высвобождающиеся при повреждении клеток (так называемых молекулярных паттернов, связанных с повреждением, — damage associated molecular patterns, DAMPs). Аналогично PAMPs (pathogen associated molecular patterns), DAMPs активируют внутриклеточный путь сигнализации с последующим синтезом провоспалительных цитокинов и формированием типичной тканевой воспалительной реакции [2, 23]. TLR могут обеспечивать механизм продукции цитокинов на границе раздела матери и плода не только в нормальных физиологических аспектах беременности, но и при ее осложнениях, например, преждевременных родах, связанных с инфекцией [9].

Плацента содержит специфические для беременности компоненты врожденной иммунной системы, потому что она представляет собой физический и иммунологический барьер от проникновения инфекционных агентов, в том числе и за счет активности TLR. Транскрипты TLR1–10 были идентифицированы в плаценте как при доношенной, так и при недоношенной беременности. В ткани плаценты при доношенной беременности, включая клетки Хофбауэра, в норме экспрессируются гены TLR2, TLR3 и TLR4 [22, 28]. По данным других авторов, для доношенной беременности также характерна продукция TLR6 [9, 24].

Большинство исследований посвящено стимуляции плацент бактериальными лигандами in vitro [11, 17, 24]. Процессам, происходящим в плаценте непосредственно перед родами или в родах, посвящено не так много работ. Уникальность представленного нами исследования состоит в том, что определены мРНК генов TLR во время элективного кесарева сечения, то есть оценен потенциал продукции TLR in vivo. Это позволяет продемонстрировать состояние Toll-рецепторов в плаценте при физиологически протекающей доношенной беременности.

Цель — оценить уровень экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR7 в плаценте при доношенной физиологически протекающей беременности, без признаков начала родовой деятельности.

Материалы и методы

Исследование выполнено на базе родильных отделений ГБУЗ «Городская клиническая больница № 1 им. Н.И. Пирогова» (Самара), в него были включены 15 беременных в сроке гестации 37–41 нед. Все пациентки были родоразрешены в плановом порядке путем кесарева сечения, показаниями к которому стали неправильное положение и предлежание плода.

Критерии исключения:

1. Беременные, относящиеся к группе высокого риска, по соматической патологии (сахарный диабет, гестационный диабет), особенностям плацентации и акушерским осложнениям (преэклампсия, синдром задержки развития плода).
2. Наличие острых и обострение хронических воспалительных заболеваний, в том числе наличие кольпита.
3. Применение антибактериальной терапии во время беременности.

Всем пациенткам было выполнено исследование образца плаценты и плодных оболочек методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ОТ-ПЦР) на базе лаборатории молекулярно-генетических методов ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия) согласно инструкциям производителя с использованием набора реагентов «Проба-НК» с дополнительной фенольной депротеинизацией. Определяли уровень экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR7. Забор образца плаценты и плодных оболочек проводили в стерильных условиях во время кесарева сечения, в пределах операционного поля. Забор плаценты выполняли посередине расстояния от места прикрепления пуповины до наиболее отдаленной точки края плаценты, с помощью конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм отсекали стандартный образец ткани плаценты, с захватом участка из глубины плаценты (с предварительным отсечением амниона, хорионической пластинки и децидуальной ткани с материнской стороны). Забор плодных оболочек проводили посередине между плацентой и внутренним зевом, с помощью стерильного конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм отсекали стандартный образец плодных оболочек. Полученные образцы помещали в «эппендорфы» с транспортной средой («Проба-НК» производства ООО «НПО ДНК-Технология»).

Результаты обрабатывали с помощью программы MS Excel на основании данных, полученных с помощью детектирующих амплификаторов DTprime. Использован метод сравнения индикаторных циклов (метод ΔCq). Уровень экспрессии генов измеряли в относительных единицах (ОЕ), отражающих представленность транскрипта относительно нормировочного фактора, рассчитанного на основе уровня экспрессии мРНК референсного гена (В2М).

Все женщины дали письменное согласие, исследование было одобрено комитетом по биоэтике СамГМУ (протокол № 207 от 20 мая 2020 г.). Гестационный возраст рассчитывали по ультразвуковому исследованию или по первому дню последней менструации.

Морфологическое исследование плаценты проводили после фиксирования тканевых структур в формалине в течение суток, промывки материала проточной водой в течение 1,5–2 ч. Затем материал подвергали дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спирте и заливали гистологические срезы в парафин. После проведения вышеперечисленных этапов материал разрезали на тонкие срезы и накладывали на обезжиренное предметное стекло, с окрашиванием в дальнейшем гематоксилином и эозином. Выявляли признаки и степень инфицирования, признаки плацентарной недостаточности, инволютивно-дистрофические изменения.

Полученные статистические данные обработаны при помощи компьютерной программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США). Определяли вид распределения данных с помощью теста Шапиро – Уилка. Описательная статистика включала в себя определение медианы (Me), интерквартильного диапазона (25–75 %) — Q₁ и Q₃. Сравнения в группах выполнены с применением критерия Манна – Уитни. Корреляции оценены с помощью рангового критерия Спирмена.

Результаты исследования

Медиана возраста обследованных женщин составила 28 лет [28; 34], срок беременности — 39,1 [39; 39, 4] нед. В среднем на одну пациентку приходилось 2,53 ± 1,81 беременностей, число первородящих — 33,33 %. У беременных отсутствовали тяжелая соматическая патология, хронические и острые воспалительные заболевания. Мазок на степень чистоты у всех пациенток был в норме. Результаты исследования экспрессии генов TLR представлены в табл. 1.

Таблица 1. Уровень экспрессии генов TLR в плодных оболочках и плаценте при физиологически протекающей доношенной беременности / Table 1. TLR gene expression level in fetal membranes and placenta during physiological full-term pregnancy

Для всех показателей уровень экспрессии был практически равным, только для TLR7 был отмечен значимо более высокий уровень в плаценте — 0,00465 ОЕ (0,00364–0,00515) по сравнению с плодными оболочками — 0,00195 ОЕ (0,00098–0,00542) (рис. 1).

Рис. 1. Экспрессия генов TLR2, TLR4, TLR7 в плаценте и плодных оболочках при доношенной беременности / Fig. 1. Expression of TLR2, TLR4, TLR7 genes in placenta and fetal membrane during full-term pregnancy

Максимальный разброс значений нами выявлен для TLR2 как в плаценте, так и в плодных оболочках, минимальный — для TLR7.

Из табл. 2 видно, что уровень TLR2 в оболочках положительно коррелирует с TLR2 плаценты и TLR4 оболочек, а, в свою очередь, TLR2 плаценты имеет положительную корреляционную связь с TLR4 и TLR7 оболочек. Плацентарные TLR4 и TLR7 не имеют корреляционных связей с остальными TLR.

Таблица 2. Корреляционная матрица для экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR7 и массы плаценты, r (p) / Table 2. Correlation matrix for TLR2, TLR4, TLR7 gene expression and placental weight, r (p)

С целью оценки влияния связи экспрессии генов TLR на новорожденного нами проведен анализ весо-ростовых показателей новорожденных, а также оценки по шкале Апгар. У всех новорожденных весо-ростовые показатели соответствовали норме: вес — 3500 г [3050; 4180], рост — 53 см [51; 57]. Все новорожденные родились с хорошей оценкой по шкале Апгар (1-я минута — 8 [7; 8] баллов; 5-я минута — 8 [8; 9] баллов). Значимых корреляций между росто-весовыми показателями новорожденных и уровнем экспрессии генов TLR нами выявлено не было.

Все последы были подвергнуты патолого-анатомическому исследованию. У всех пациенток клинических данных о какой-либо акушерской патологии не было, но при этом в ряде случаев патологоанатомическое исследование продемонстрировало признаки воспалительного процесса и хронической плацентарной недостаточности. Так, соответствие плаценты сроку гестации наблюдалось только в 5 случаях (33,33 %), гипоплазия плаценты — в 2 (13,33 %), патологическая незрелость ворсин — в 9 (60 %), инволютивно-дистрофические нарушения — в 8 (53,33 %), компенсаторные реакции — в 8 (53,33 %), париетальный хориоамнионит — в 10 (66,67 %), хроническая плацентарная недостаточность — в 11 (73,33 %), отек плодных оболочек — в 5 (33,33 %) случаях.

Нами был проведен анализ связи гистологических изменений плаценты и плодных оболочек с уровнем экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR7. Медиана массы плацент составила 410 г [370; 450]. Уровень экспрессии генов всех вышеперечисленных TLR имел значимые положительные корреляции с массой плаценты (табл. 2), кроме TLR4 в плаценте и TLR2 в оболочках. Видимо, уровень экспрессии генов в целом зависит от плацентарной массы, как органа, в котором экспрессируются данные гены.

Вышеперечисленные гистологические признаки (есть/нет) особенностей плаценты анализировали с помощью критерия Манна – Уитни, значимые различия были установлены для уровня экспрессии гена TLR2 в плаценте и патологической незрелости ворсин. У беременных без патологической незрелости ворсин уровень экспрессии TLR2 плаценты был в десятки раз выше, чем у пациенток с патологической незрелостью (0,012 ОЕ [0, 008; 0, 014]и 0,002 ОЕ [0, 002; 0, 006] соответственно, Z = 2,13; p = 0,03). Основные различия наблюдались для экспрессии гена TLR4 в плаценте и при гистологических изменениях последа (рис. 2).

Рис. 2. Уровень экспрессии гена TLR4 в плаценте при различных ее патолого-анатомических изменениях (относительные единицы, р < 0,05) / Fig. 2. The level of the TLR4 gene expression in the placenta in case of various pathological changes in it (relative units, р < 0.05)

Обсуждение результатов

Основные продуценты TLRs при доношенной беременности — децидуальные макрофаги, клетки Хофбауэра. При доношенной беременности экспрессия генов TLR2, TLR3, TLR4 [22, 28] в разы превышает таковую в первом триместре.

Представленность TLRs в разных отделах репродуктивного тракта строго специфична [18]: эпителиальные клетки влагалища и эндоцервикса экспрессируют гены TLR1–3, TLR5 и TLR6 [14], эндометриальные клетки — TLRs 1–10-го типов, что обусловлено необходимостью ответа на широкий диапазон микробных агентов [6].

Основные рецепторы, распознающие бактериальный компонент на поверхности клеток — TLR2 и TLR4, в свою очередь, запускают продукцию противовоспалительных цитокинов и хемокинов [25, 26]. TLR7 как внутриклеточный рецептор локализуется в эндосомах и активируется одноцепочечными молекулами РНК вирусов, служа, наряду с TLR3 и TLR9, компонентом антивирусной системы защиты организма [1].

Инфекционные процессы, в том числе преждевременные роды, хорионамнионит, хронический эндометрит [3] ассоциированы с повышенной экспрессией TLR4 [1, 5, 25]. А полиморфизм гена Asp299Gly TLR4 связан с нарушением функции рецептора TLR4 и повышенной вероятностью грамотрицательного сепсиса [7].

Роль TLR7 также недостаточно изучена, хотя известно, что данный рецептор участвует в реализации врожденного иммунитета против вирусов (ssРНК вируса) и клеток хозяина (ssРНК хозяина), а также в реализации приобретенного иммунитета. Происходит стимуляция функций антигенраспознающих клеток и регуляторных Т-лимфоцитов, которые начинают активно продуцировать TLR7. Так, доказана связь уровня TLR7 с системной красной волчанкой — заболеванием, ассоциированным с женским полом [13, 19].

Наше исследование позволяет объективно с помощью современных методов (ОТ-ПЦР) оценить состояние Toll-рецепторов в плаценте и плодных оболочках при физиологически протекающей доношенной беременности, их коррелированность между собой. В результате гистологического исследования плаценты были выявлены некоторые закономерности экспрессии Toll-рецепторов: «закулисные» компенсированные воспалительные реакции, без клинических проявлений и каких-либо негативных последствий для матери и плода на фоне повышенной экспрессии TLR4 в плаценте.

На протяжении всей беременности все TLR экспрессируются на границе раздела матери и плода в пространственно-временной области специфическим образом [21, 24]. TLR2 и TLR4 экспрессируются в синцитиотрофобластах на протяжении всей беременности, причем наибольшая экспрессия наблюдается в третьем триместре [8, 17], возможно, для сдерживания шейно-вагинальных инфекций, которые могут поставить под угрозу продолжение беременности в этот критический период.

Основные механизмы, контролирующие пространственно-временную регуляцию TLR у матери и плода, все еще нуждаются в разъяснении. Во время беременности TLR экспрессируют клетки трофобласта, клетки Хофбауэра и эндотелиальные клетки, децидуальные и хориоамниотические мембраны. Кроме того, растворимая форма TLR2 также присутствует в амниотической жидкости [12], что снижает провоспалительную передачу сигналов лиганда, секвестрирует и, следовательно, снижает активацию TLR2 в амниотическом эпителии.

Как упоминалось ранее, клетки Хофбауэра обычно считаются неэффективными для контроля вирусных инфекций, даже если они экспрессируют TLR3, который распознает двухцепочечную вирусную РНК [28]. Тем не менее повышенная секреция интерлейкинов 6 и 8 клетками Хофбауэра наблюдалась после обработки полисинтетическим аналогом двухцепочечной РНК, что свидетельствует о важной роли этих клеток в контроле вирусных инфекций [28]. С другой стороны, клетки Хофбауэра активно экспрессируют TLR2 и TLR4 [22, 28], что позволяет им легко реагировать на грамположительные и грамотрицательные бактерии. Фактически, клетки Хофбауэра у пациенток с хориоамнионитом сверхэкспрессируют TLR4, возможно, для усиления воспалительных сигналов, сдерживающих бактериальные инфекции [22].

Интересно, что децидуальная оболочка первого триместра продуцирует в два раза или даже больше мРНК для большинства TLR по сравнению с децидуальной тканью при доношенной беременности, за исключением TLR2, TLR7 и TLR9, экспрессия которых оставалась постоянной на протяжении всей беременности [20]. Подобный паттерн экспрессии TLR, вероятно, связан с потребностью в более безопасной среде для высокоактивной децидуальной оболочки в начале беременности, тогда как в третьем триместре плацента берет на себя мониторинг и контроль уровня воздействия микробного антигена. Клинически значимое повышение TLR2 было продемонстрировано в децидуальной ткани при преждевременных родах, связанных с инфекцией [14, 18].

Что касается хориоамниотических мембран, они экспрессируют все десять TLR на протяжении всей беременности [5, 16]. В частности, экспрессия TLR4 на апикальной стороне амниотического эпителия позволяет ему реагировать на наличие возбудителя в околоплодных водах. Эта экспрессия TLR4 вместе с TLR2 индуцируется при хориоамнионите [27]. Кроме того, продемонстрировано, что прогестерон уменьшает хориоамниотическую экспрессию TLR4. Возможно, это компенсаторный механизм для ограничения продукции провоспалительных цитокинов в случае воздействия воспалительного стимула, который может подвергнуть опасности мать или плод [15].

В нашем исследовании уровни экспрессии TLR4 и TLR7 в плаценте не зависели от других показателей (TLR2 — в оболочках и плаценте, TLR4 и TLR7 — в оболочках), связанных между собой. Вероятно наличие данных корреляций связано с распределением клеток (моноцитов, макрофагов, дендритных клеток, эпителиальных клеток, а особенно — клеток Хофбауэра). Клетки Хофбауэра располагаются исключительно в плаценте и, по всей видимости, экспрессия TLR4 и TLR7 в плаценте происходит изолированно, тогда как остальные Toll-подобные рецепторы были связаны между собой. Их минимальный разброс также свидетельствует в пользу определенной стабильности в глубине тканей плаценты этих показателей, в то время как вероятность контакта оболочек с микроорганизмами урогенитального тракта выше и, соответственно, размах этих показателей варьирует сильнее.

Достаточно сложно сравнивать наши результаты экспрессии генов с результатами других авторов, так как нормализация проводится по разным референсным генам, однако можно сделать вывод, что наиболее значимым показателем реакции на воспалительный процесс, особенно бактериального происхождения, является TLR4, что соответствует полученным результатам и данным литературы [15, 27]. Только для этого показателя мы получили статистически значимые различия: при инволютивно-дистрофических и воспалительных изменениях в плаценте экспрессия TLR4 была выше, но при наличии патологической незрелости ворсин уровень TLR4 был ниже, чем в плацентах с нормальным созреванием ворсин. Для остальных TLR значимых различий выявлено не было.

Физиологическое значение присутствия TLR в тканях гестации в том, что возможная инфекция мочеполовых путей может прервать беременность из-за раннего развития сигналов, связанных с родами, вызывая преждевременный разрыв плодных оболочек, что этиологически в большинстве случаев ассоциировано с внутриутробными бактериальными инфекциями [27].

Заключение

Из исследованных Toll-подобных рецепторов наиболее чувствительный индикатор воспалительного процесса — экспрессия TLR4 в плаценте, которая уже на доклиническом этапе коррелирует с инволютивно-дистрофическими и воспалительными изменениями в плаценте. Уровень экспрессии TLR в плодных оболочках и плаценте значимо не различался, только для TLR7 экспрессия в плаценте была почти в 2 раза выше, чем в плодных оболочках. Эти два показателя не имели корреляций c оставшимися TLRs, которые между собой имеют сильные положительные корреляции. Экспрессия TLR закономерно зависела от массы плаценты.

Таким образом, исследование экспрессии TLR должно стать важным показателем в диагностике воспалительного процесса на уровне фетоплацентарного комплекса, так как эти гены — основные звенья в реализации врожденного антибактериального и противовирусного иммунитета.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Maria A. Kaganova

Author for correspondence.
Email: mkaganova@yandex.ru

Candidate of Medical Science, Associate Professor, Obstetrics and Gynecology Department, IPE

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Expression of TLR2, TLR4, TLR7 genes in placenta and fetal membrane during full-term pregnancy

Download (100KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. The level of the TLR4 gene expression in the placenta in case of various pathological changes in it (relative units, р < 0.05)

Download (77KB)

Indexing metadata