In-vitro modeling of a biofilm of endoparodontal focus of infection

Full Text

Обоснование

В литературе известно достаточно большое количество экспериментальных моделей, позволяющих изучать in vitro процессы жизнедеятельности микроорганизмов, заселяющих корневые каналы и пародонтальные карманы при патологических состояниях [1, 4]. Так, например, существует метод микробиологического изучения патологического содержимого корневых каналов и пародонтальных карманов путем количественных высевов на питательную среду [6]. Известен также способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде [5, 7].

Однако в организме человека биопленка формируется в условиях омывания жидкими секретами, то есть в условиях текучих сред, что обеспечивает дифференцировку клеточных слоев биопленки, постоянный приток питательных веществ и отток продуктов метаболизма [3, 8]. Кроме того, пути сообщения между тканями эндодонта и пародонта, имеющиеся в естественных условиях, могут значительно влиять на формирование биопленки при сочетанных эндопародонтальных поражениях [2]. Таким образом, существует потребность в создании способа формирования биопленки эндодонто- и пародонтопатогенных бактерий в условиях текучих сред in vitro, с учетом вышеуказанных требований.

Цель исследования — создание модели эндопародонтального очага инфекции in vitro.

Материалы и методы

Наиболее близким к условиям полости рта является способ формирования смешанной биопленки периодонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro, который был взят нами за прототип [3].

Данный способ осуществляется следующим образом. Бактериальную взвесь из чистой культуры, разведенной в 0,1 % полужидкой агаризованной среде — сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01 % менадиона и 0,1 % гемина — стимуляторов роста анаэробных бактерий, до концентрации 106–108 КОЕ/мл, помещают на подложку из полимерных материалов (метилметакрилат, полиуретан, триацетат или плотную агаровую питательную среду) в замкнутой емкости. Емкость помещается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80 % азота, 10 % водорода, 10 % углекислого газа, а микроанаэростат в свою очередь, помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60–120 движений в минуту при постоянной температуре культивирования биопленки 37 °С.

Главный недостаток этого метода — отсутствие возможности исследовать взаимное влияние эндодонто- и пародонтопатогенных бактерий через естественные пути сообщения, а также антимикробную эффективность способов хемомеханической обработки корневых каналов и пародонтальных карманов, так как все они нуждаются в воссоздании модели зуба и окружающих его тканей.

Для достижения указанного технического результата нами предлагается создание модели эндопародонтального очага инфекции in vitro, включающей следующие этапы:

1-й этап. Подготовка подложки для микроорганизмов, в качестве которой выступают удаленные человеческие зубы, оттискная масса и пробирка с силиконовой крышкой. Для этого корневые каналы удаленных зубов инструментально расширяют до 80-го размера по ISO для облегчения вхождения инструментов и растворов в ходе дальнейших манипуляций. На внешнюю поверхность корня зуба также наносят насечки, имитирующие нарушение целостности цемента во время прогрессирования пародонтита и периодонтита. Подготовленные зубы помещают в стеклянную пробирку с С-силиконом (рис. 1–3), при этом между корнем зуба и оттискной массой создается пространство для имитации пародонтального кармана. Далее образцы с силиконовой крышкой помещают в крафт-пакеты, после чего стерилизуют в автоклаве при температуре 132 °С, 2,2 атм., в течение 20 мин (рис. 4, 5). Стерильность изготовленной подложки была проверена и подтверждена. Для проведения эксперимента нами было подготовленно 30 подложек по вышеописанной методике.

Рис. 1. Стеклянная пробирка

Fig. 1. Glass test tube

Рис. 2. Замешивание оттискной массы

Fig. 2. Mixing the impression compound

Рис. 3. Помещение зуба в оттискную массу

Fig. 3. Placement of the tooth into the impression compound

Рис. 4. Стерилизация моделей в автоклаве

Fig. 4. Sterilization of models in the autoclave

Рис. 5. Образец опытной модели

Fig. 5. Sample prototype

2-й этап. Взятие содержимого пародонтального кармана и корневого канала у пациентов с эндопародонтальными поражениями, его транспортировка в среде Кэрри – Блэр (рис. 6), идентификация микроорганизмов методом масс-спектрометрии, выделение монокультур.

Рис. 6. Взятие содержимого корневого пародонтального кармана и корневого канала и его транспортировка в среде Кэрри – Блэр

Fig. 6. Collection the content of the periodontal pocket and root canal and transporting it in the Cary–Blair transport medium

Нами был взят материал у 12 пациентов с исследуемой патологией. Чаще всего в корневом канале и в пародонтальном кармане нами были обнаружены следующие микроорганизмы: 1) облигатные анаэробы Veilonella spp., Fusobacterium nucleatum; 2) факультативные анаэробы Streptococcus mutans, Granulicatella adiacens, Str. intermedius, Str. Oralis, Str. Sangius.

Видовой состав микрофлоры эндодонтического канала и пародонтального кармана был схожим, что подтвердило сочетанное течение патологии у исследуемых пациентов.

3-й этап включает внесение на ранее изготовленную подложку бактериальной взвеси и ее культивацию, при этом бактериальную взвесь разводят в жидкой тиогликолиевой среде, до концентрации 106–108 КОЕ/мл, подложку помещают в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80 % азота, 10 % водорода, 10 % углекислого газа, который, в свою очередь, помещают в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в диапазоне 120 движений в минуту при температуре 37 °C в течение 5 сут (рис. 7).

Рис. 7. Этапы создания энокулюмов, выделение монокультур

Fig. 7. Stages of enoculum creation, isolation of monocultures

Результаты и их обсуждение

После выдерживания моделей в шейкер-термостате нами осуществлялось взятие содержимого корневого канала и пародонтального кармана из разработанных моделей и проводилась идентификация микроорганизмов методом масс-спектрометрии, выделение монокультур (рис. 8–10).

Рис. 8. Колония Str. intermedius на чашке Петри

Fig. 8. Colony of Str. intermedius in a Petri dish

Рис. 9. Колония Gran. adiacens на чашке Петри

Fig. 9. Colony of Gran. adiacens in a Petri dish

Рис. 10. Колония Str. mutans на чашке Петри

Fig. 10. Colony of Str. mutans in a Petri dish

После идентификации микроорганизмов нами были обнаружены следующие бактерии: Veilonella spp., Fusobacterium nucleatum, Str. mutans, Granulicatella adiacens, Str. intermedius, Str. Oralis, Str. Sangius.

Следовательно, предложенная модель эффективна для культивирования облигатно-анаэробных и факультативно-анаэробных культур. Созданная нами анаэробная среда, имитирующая анатомо-физиологические условия для развития эндопародонтальной инфекции, достоверна и может быть использована для изучения свойств патогенной микрофлоры биопленки корневого канала и пародонтального кармана.

Выводы

Техническим результатом предлагаемого способа стало максимально близкое воссоздание многовидовой смешанной бактериальной биопленки непосредственно в тканях зуба в среде, приближенной к условиям развития эндопародонтальных поражений in vivo с возможностью симуляции системы корневых каналов и пародонтальных карманов in vitro при дальнейшем тестировании способов хемомеханической и физической обработки на полученной модели. Возможности исследования воздействия на микробную биопленку, сформированную предлагаемым способом, очень широки, а их результаты являются достоверными, так как данная модель по сравнению с известными наиболее точно отражает развитие многовидовой биопленки непосредственно в условиях зубных тканей.

About the authors

Sofya I. Ginnatulina

Author for correspondence.
Email: gsi1993@yandex.ru

Full-time postgraduate student, Department of Therapeutic Dentistry

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Glass test tube

Download (59KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Mixing the impression compound

Download (73KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Placement of the tooth into the impression compound

Download (56KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Sterilization of models in the autoclave

Download (88KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Sample prototype

Download (70KB)

Indexing metadata

7. Fig. 6. Collection the content of the periodontal pocket and root canal and transporting it in the Cary–Blair transport medium

Download (170KB)

Indexing metadata

8. Fig. 7. Stages of enoculum creation, isolation of monocultures

Download (207KB)

Indexing metadata

9. Fig. 8. Colony of Str. intermedius in a Petri dish

Download (32KB)

Indexing metadata

10. Fig. 9. Colony of Gran. adiacens in a Petri dish

Download (36KB)

Indexing metadata

11. Fig. 10. Colony of Str. mutans in a Petri dish

Download (30KB)

Indexing metadata