Anaerobic dysbiosis of the cervical canal as a risk factor for premature rupture of membranes

Full Text

Обоснование

Преждевременное излитие околоплодных вод как минимум за час до начала родов встречается, по данным различных авторов, от 2,7 до 17 % случаев [11, 26]. Преждевременный разрыв плодных оболочек (ПРПО) при доношенной беременности ассоциирован с высоким процентом аномалий родовой деятельности, дистресса плода, родового травматизма, септических осложнений как для матери, так и для новорожденного [26]. Развитие вышеперечисленных осложнений при ПРПО, а также отказ пациенток от подготовки шейки матки, либо ее неэффективность, увеличение продолжительности родов и неготовность рожениц к такой продолжительности родов приводят к увеличению процента кесаревых сечений у данного контингента пациенток и, как правило, это первородящие пациентки. Соответственно, решение проблемы ведения рожениц с ПРПО при доношенной беременности позволит сократить процент кесаревых сечений, а также снизить материнскую и перинатальную заболеваемость.

Связь инфекционного фактора ПРПО при недоношенной беременности доказана большим количеством работ [14, 21, 23, 24]. Современные исследования демонстрируют как одну из ведущих причин преждевременного излития околоплодных вод воспалительные изменения плодных оболочек за счет восходящей инфекции [10]. Анализ микрофлоры влагалища и цервикального канала у пациенток с дородовым излитием позволит объяснить роль микробного фактора в реализации ПРПО при доношенной беременности.

В отечественной и зарубежной литературе предложены методические рекомендации по исследованию вагинальной микрофлоры, в которых разработаны критерии нормы и инфекционной патологии [5, 12]. Способ интегральной оценки состояния микробиоты влагалища и диагностика оппортунистических вагинитов [1] позволяют установить видовой состав эробных, факультативно- и облигатно-анаэробных бактерий, микроаэрофилов, в том числе лактобацилл, а также дрожжевых грибов рода Candida. В литературе описаны изменения биоценоза влагалища у пациенток с ПРПО при доношенной беременности [3], однако не представлены четкие критерии содержания отдельных видов микроорганизмов при данной патологии для более близкорасположенной к плоду топике — цервикального канала.

На основании количественной оценки роста микроорганизмов на питательных средах определяется их этиологическая значимость. Разработаны критерии нормы вагинальной микробиоты у женщин репродуктивного возраста: общая микробная обсемененность не превышает 106–108 КОЕ/мл; абсолютное преобладание лактобацилл; условно-патогенные микроорганизмы определяются в низком титре (менее 104 КОЕ/мл) или отсутствуют [12]. Также приведены характеристики различных нарушений вагинальной микрофлоры (бактериальный вагиноз (БВ), кандидозный вагинит (KB), сочетание БВ и KB, бессимптомное носительство грибов, неспецифический (аэробный) вагинит, мезоценоз, цитолитический вагиноз, вагинальная эпителиальная атрофия [15]. Однако вышеописанные критерии разработаны для оценки вагинального биотопа и не учитывают особенности микрофлоры слизистой оболочки цервикального канала, который является основным барьером, отделяющим плодные оболочки от внешней среды.

В последние годы появился новый подход к исследованию условно-патогенной микрофлоры — метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени» «Фемофлор-16», который дает возможность исследовать микрофлору и оценить степень и характер дисбаланса микробиоты влагалища. Ближайший аналог предлагаемого способа — метод диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности [16]. Суть метода ПЦР в режиме «реального времени» заключается в том, что в исследуемой биопробе определяют общее число геномов микроорганизмов, характерных для конкретного биотопа, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты. Полученные величины сопоставляют между собой, определяют соотношение числа нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз, констатируют отсутствие дисбаланса в составе микрофлоры, оценивая данный показатель как вариант нормы. При значении данного показателя менее чем в 1000 раз, диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения между числом геномов нормобиоты и общим числом геномов микроорганизмов, присутствующих в исследуемой пробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты. При снижении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов в 10–100 раз и снижении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 100–1000 раз устанавливают легкую степень дисбаланса. При превышении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз и превышении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 10 раз и более этой величины устанавливают выраженную степень дисбаланса. В основу способа положена предлагаемая авторами комплексная оценка микробиоты человека методом ПЦР в «реальном времени» с проведением сравнительного анализа конкретных представителей нормо- и условно-патогенной биоты с общим количеством микроорганизмов с целью определения дисбаланса биоты, степени его выраженности при условии контролирования качества получения исследуемой биопробы. Недостатком метода является отсутствие учета особенностей микробного пейзажа слизистой оболочки цервикального канала, вариантов нормы распределения различных биотопов в цервикальном канале, с указанием конкретных групп микроорганизмов, что затрудняет его использование для этиологической диагностики патологических процессов в шейке матки, связанных с преждевременным излитием околоплодных вод.

Цель исследования — с помощью ПЦР-РВ анализа мазка цервикального канала выявить наиболее значимые предикторы преждевременного разрыва плодных оболочек при доношенной беременности.

Материалы и методы

На базе родовых отделений ГБУЗ ГКБ № 1 им. Н.И. Пирогова Самары в исследование включены 47 пациенток со сроком беременности 37–42 нед. Из них основную группу с ПРПО составили 28 пациенток и 19 пациенток вошли в группу контроля с интактными плодными оболочками. Все пациентки были родоразрешены путем операции кесарево сечение. В группе контроля родоразрешение выполнялось в плановом порядке (показаниями к операции были неправильное положение и предлежание плода, наличие рубца на матке после предыдущего кесарева сечения, бесплодие в сочетании с отягощенным акушерским анамнезом, возраст), в группе с ПРПО показания были те же, но операция выполнена в срочном порядке не позднее 6 ч с момента излития околоплодных вод, при условии отсутствия родовой деятельности и неподготовленных родовых путях.

Критерии исключения:

1) беременные, относящиеся к группе высокого риска, согласно порядку оказания помощи по профилю: «Акушерство и гинекология» № 572 от 01.11.2012 г., по соматической патологии (сахарный диабет, гестационный диабет), особенностям плацентации и акушерской патологии (преэклампсия, плацентарная недостаточность);

2) наличие острых и обострений хронических воспалительных заболеваний, в том числе наличие кольпита во время беременности;

3) антибактериальная терапия при беременности.

Мазки из цервикального канала брали у пациенток перед операцией. Исследование содержимого цервикального канала выполняли методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (Фемофлор-16) и применением детектирующего амплификатора ДТ-96 производства ООО «НПО ДНК-Технология» (РУ ФСР 2009/04663, патент № 2362808 от 13.02.08). Исходно методика Фемофлор-16 была разработана для оценки состояния влагалища, а нами была использована с целью оценки микробного пейзажа цервикального канала. Данная технология предусматривает анализ биоты различных биотопов, в том числе и цервикального канала [2, 9], включающего определение микроорганизмов: Lactobacillus spp., Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp. / Leptotrihia spp. / Fusobacterium spp., Megasphaera spp. / Veillonella spp. / Dialister spp., Lachnobacterium spp. / Clostridium spp., Mobiluncus spp. / Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma (urealyticum + parvum), Candida spp. Результат исследования выдается либо в десятичных логарифмах соответствующих количеству ГЭ/образец, либо в процентном соотношении по общей бактериальной массе (ОБМ).

Статистический анализ. Обработку результатов исследования проводили с помощью программы Statistica 10.0, SPSS 13. Для описания количественных данных использована медиана (Ме), а в качестве интервальной оценки — верхний (Q1) и нижний (Q3) квартили, так как исследуемые выборки не подчиняются закону нормального распределения (несоответствие нормальному распределению определено методом Шапиро – Уилка), к количественным переменным относились натуральные логарифмы содержания различных видов микроорганизмов в анализе ПЦР в режиме реального времени. Остальные признаки относились к бинарным качественным переменным по типу есть/нет, частоты приведены в абсолютных числах и процентах. Анализ качественных признаков проводили с помощью таблиц сопряженности, с применением критерия хи-квадрат либо двустороннего критерия Фишера. Построение деревьев классификации выполнено с помощью модуля Classification and Regression Trees (CART). Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты исследования. Исследуемые группы были сопоставимы между собой по возрасту (32,2 ± 5,4 и 31,0 ± 5,3 года; Т = 0,73; р = 0,46), паритету родов (число первородящих в основной группе — 51,6 %, в контрольной — 36,8 %, р = 0,14) и беременностей (2,29 ± 1,21 и 2,47 ± 1,71; Т = –0,44; р = 0,79). Средний срок гестации в основной группе был ниже (38,2 ± 0,92 нед.), чем в контрольной группе (39,3 ± 0,65 нед.; Т = –4,74; р = 0,000). Результаты анализа ПЦР-РВ образцов плаценты представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Микробный пейзаж цервикального канала при доношенной беременности в зависимости от целостности плодного пузыря, определенный методом ПЦР-РВ

Table 1. The microbial landscape of the cervical canal, detecting by RT-PCR, in terms of intact or ruptured fetal membrane in full-term pregnancy

	Основная группа		Группа контроля		p1 (двусторонний точный критерий Фишера)	p2 (критерий Манна – Уитни)
	n	Ме (Q1; Q3)	n	Ме (Q1; Q3)
КВМ	28 (100 %)	4,9 (4,6; 5,1)	19 (100 %)	5,8 (5,5; 6,1)	1	U = 24,5; p = 0,000
ОБМ	28 (100 %)	6,0 (5,3; 6,5)	19 (100 %)	7,5 (7,0; 8,1)	1	U = 39,5; p = 0,000
Lactobacillus spp.	26 (92,8 %)	5,3 (5,1; 6,4)	19 (100 %)	7,6 (7,1; 8,2)	0,51	U = 21; p = 0,000
сем. Enterobacteriaceae	6 (21,4 %)	3,2 (3,1; 3,4)	7 (37 %)	3,3 (3,1; 3,6)	0,327	U = 14; p = 0,79
Streptococcus spp.	7 (25 %)	3,6 (3,3; 3,9)	4 (21 %)	4,0 (3,7; 4,7)	0,947	U = 5,5; p = 0,32
Staphylococcus spp.	13 (46,4 %)	3,9 (3,2; 4,3)	16 (84 %)	3,4 (3,3; 3,9)	0,008	U = 58; p = 0,36
Gardnerella vaginalis + Prevotella bivia + Porphyromonas spp.	21 (75 %)	4,3 (4,0; 4,9)	15 (79 %)	4,2 (3,2; 5,2)	0,941	U = 98; p = 0,62
Eubacterium spp.	19 (67,8 %)	4,4 (3,9; 5,5)	13 (68 %)	4,4 (4,2; 6,4)	0,323	U = 62,5; p = 0,31
Sneathia spp. + Leptotrichia spp. + Fusobacterium spp.	4 (14,3 %)	5,0 (3,1; 6,6)	2 (11 %)	4,0 (3,3; 4,7)	0,88	U = 2; p = 0,77
Megasphaera spp. + Veillonella spp. + Dialister spp.	18 (64,3 %)	4,3 (3,6; 5,2)	9 (47 %)	3,9 (3,3; 4,7)	0,377	U = 42; p = 0,36
Lachnobacterium spp. + Clostridium spp.	8 (28,6 %)	4,5 (4,4; 4,9)	6 (32 %)	4,7 (4,2; 5,3)	0,534	U = 9,5; p = 0,67
Mobiluncus spp. + Corynebacterium spp.	13 (46,4 %)	3,8 (3,4; 4)	12 (63 %)	4,1 (3,4; 4,6)	0,310	U = 45,5; p = 0,76
Peptostreptococcus spp.	10 (35,7 %)	4,0 (3,0; 4,8)	7 (37 %)	3,3 (3,2; 4,2)	0,774	U = 21,5; p = 0,8
Atopobium vaginae	9 (32,1 %)	3,3 (2,0; 6,2)	6 (32 %)	2,1 (2,1; 2,8)	0,853	U = 13,0; p = 0,34
Candida spp.	8 (28,6 %)	3,7 (3,5; 4,4)	4 (21 %)	4,2 (3,3; 5,0)	0,959	U = 8,5; p = 0,54
Mycoplasma hominis*	2 (7,1 %)	3,0	0 (0 %)	–	0,203	1
Ureaplasma (urealyticum + parvum)*	11 (39,2 %)	3,9 (3,3; 4,3)	8 (42 %)	4,2 (3,8; 4,6)	0,430	U = 25; p = 0,62
Mycoplasma genitalium*	1 (3,6 %)		0 (0 %)	–	0,374	–
Сумма анаэробов		11,49 (7,81; 14,27)		11,28 (6,16; 14,40)		0,72

Примечание. * Качественный анализ (есть/нет). КВМ — качество взятия материала; ОБМ — общая бактериальная масса.

Note. * Binominal analysis (present/absent). КВМ — total bacterial mass; ОБМ — collection quality material.

 

Основные представители нормофлоры отделяемого влагалища у здоровых женщин репродуктивного возраста — это представители рода Lactobacillus spp. В норме на долю Н2О2 продуцирующих Lactobacillus spp. приходится от 80 до 100 % всех микроорганизмов (по: Nugentatal, 1991; А.Л. Тихомиров, Ч.Г. Олейник, 2004). У здоровых женщин абсолютное количество Lactobacillus spp. практически не отличается от общего количества бактерий, то есть составляет 106–108 [1]. Наличие Lactobacillus spp. в цервикальном канале также является вариантом нормы и в процентном соотношении должно преобладать над другими микроорганизмами (более 80 %). В нашем случае абсолютное количество Lactobacillus spp. было ниже в основной группе (медиана 105,8), чем в контрольной — 107,6 (р = 0,000). В 2 случаях (10 %) в основной группе Lactobacillus spp. выявлены не были.

ОБМ в основной группе составила 6,0 (5,3; 6,5) в Гэ/образец, что значимо ниже, чем в контрольной — 7,5 (7,0; 8,1) Гэ/образец (p < 0,001). На первом месте по частоте выявления были Staphylococcus spp. в контрольной группе — 16 (84 %), в основной — 13 (46,4 %, р = 0,008). Несмотря на то что в контрольной группе различные виды Staphylococcus spp. выделялись чаще, но при этом в более низком абсолютном количестве, поэтому на фоне преобладания Lactobacillus spp. данные результаты были отнесены к варианту нормы.

Частота выявления представителей семейств Enterobacteriaceae spp., Streptococcus spp. была сопоставима в группах: 6 (21,4 %) и 7 (25 %) в основной группе, 7 (37 %) и 4 (21 %) в группе сравнения (р = 0,327; р = 0,947) соответственно.

При ПРПО не отмечено преобладания каких-либо видов облигатной анаэробной микрофлоры как в количественном соотношении, например Gardnerella vaginalis + Prevotella bivia + Porphyromonas spp., так и по частоте выявления: 21 (75 %) и 104,3 Гэ/образец в основной группе, 15 (78,9 %) и 104,2 Гэ/образец в контрольной (р = 0,9). Eubacterium spp. определялись одинаково часто в обеих группах: 19 (67,8 %) и 13 (68,4 %) соответственно (р = 0,9), процентное соотношение в составе остальной микрофлоры также не различалось.

Анаэробы: Sneathia spp. + Leptotrichia spp. + + Fusobacterium spp., Megasphaera spp. + Veillonella spp. + Dialister spp., Lachnobacterium spp. + + Clostridium spp., Peptostreptococcus spp. наблюдались в основной группе чаще и в большей абсолютной и относительной концентрации (рис. 1), что подтверждает наше предположение о преобладании анаэробной микрофлоры у пациенток с ПРПО.

 

Рисунок. Относительная частота (количество выявленного микроорганизма по отношению к общей бактериальной массе) в мазке из цервикального канала (* выделены микроорганизмы, различающиеся с уровнем значимости р < 0,05)

Figure. Relative frequency (the number of detected microorganisms in relation to the total bacterial mass) in a smear from the cervical canal (* microorganisms had various significance level of p < 0.05)

 

Микоплазмы (Mycoplasma hominis, Мycoplasma genitalium) наблюдались только в основной группе. Ureaplasma (urealyticum + + parvum) с одинаковой частотой встречалась в обеих группах.

В результате построения деревьев классификации были выявлены следующие факторы риска преждевременного разрыва плодных оболочек: количество Lactobacillus spp. менее 99,3 % (чувствительность 75 %, специфичность 68 %); совокупная анаэробная микрофлора выше 0,55 % (чувствительность 71 %, специфичность 68 %); Gardnerella vaginalis /Prevotellabivia / Porphyromonas spp. более 0,08 % (чувствительность 64,3 %, специфичность 73,7 %); Megasphaera spp. / Veilonella spp. /Dialister spp. более 0,06 % (чувствительность 66,7 %, специфичность 52,6 %). При выявлении хотя бы одного из вышеперечисленных критериев пациентки относятся к группе высокого риска по преждевременному излитию околоплодных вод. При учете всех четырех показателей распределения микроорганизмов чувствительность метода составляет 85,5 %, специфичность — 68,4 %, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов диагностики (точность модели) равнялись 78,7 %.

Результаты исследования и их обсуждение

Нормальная микрофлора влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста содержит грамположительные и грамотрицательные аэробные, факультативно-аэробные и облигатно-анаэробные микроорганизмы, при этом 95–98 % всех микроорганизмов представлено Lactobacillus spp. [17]. К нормальной микрофлоре относятся также Mycoplasma hominis в титре менее 104 КОЕ/мл, грибы рода Candida в титре менее 103 КОЕ/мл [4]. Применение методики ПЦР с детекцией в режиме реального времени перспективно в плане исследования биотопа не только влагалища, но и цервикального канала. Однако показатели нормы для этой методики для различных биотопов пока окончательно не разработаны, особенно во время беременности. Наши исследования продемонстрировали, что ОБМ при ПРПО значимо ниже, чем при интактном плодном пузыре, при этом наблюдается снижение абсолютного и относительного количества Lactobacillus spp. и преобладание облигатных анаэробов. Низкую ОБМ можно связать с антимикробной активностью околоплодных вод, что, соответственно, приводит к снижению обсемененности цервикального канала бактериальной флорой в сравнении с группой пациенток без отхождения околоплодных вод.

Согласно результатам нашего исследования, различные виды Staphylococcus spp. в небольшом количестве (103,3–103,9) являются наиболее распространенными представителями биотопа цервикального канала, относятся к нормальной микрофлоре и присутствуют практически у всех пациенток контрольной группы, в отличие от основной группы. Наши данные подтверждает ряд других работ, в которых Staphylococcus spp. отнесены к нормальной микробиоте и встречаются на всем протяжении желудочно-кишечного тракта [6, 25]. Изменение особенностей местного иммунитета приводит к усиленному размножению Staphylococcus spp. в половых путях.

Анализ ПЦР в режиме реального времени позволяет идентифицировать семейство Еnterobacteriaceae, представители которого чаще наблюдались в контрольной группе — 7 (37 %) случаев, тогда как в основной — лишь в 6 (21,4 %) случаях (р = 0,327).

В целом, большинство вышеперечисленных условно-патогенных микроорганизмов входят в список бактерий, ассоциированных с аэробным вагинитом (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus Group B), и многочисленными работами продемонстрирована их связь с неблагоприятными исходами беременности [7, 8, 20], такими как преждевременные роды, ПРПО, ранний неонатальный сепсис, хориоамниониты и послеродовые метроэндометриты.

Что касается анаэробной флоры, суммарный процент согласно расчету более 0,55 % является фактором риска ПРПО. Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp. является микроорганизмом, наиболее часто ассоциированным с бактериальным вагинозом, микроорганизмом, который связан с неблагоприятными исходами беременности — самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды [19]. В нашем исследовании фактором риска является содержание Gardnerella vaginalis / Prevotellabivia / Porphyromonas spp. свыше 0,08 % относительно общей бактериальной массы.

Из всего многообразия участников формирования дисбиоза влагалища в отношении фактора-предиктора ПРПО нами были выделены Megasphaera spp. / Veilonella spp. /Dialister spp., относящиеся к классу Clostridia, порядку Clostridiales, семейству Veillonellaceae. Megasphaera spp., которые входят в резидентную микрофлору толстой кишки человека. В процессе жизнедеятельности Megasphaera продуцируют короткоцепочечные жирные кислоты: масляную, изомасляную, валериановую, капроновую, изовалериановую, изокапроновую [13]. Veillonella spp. (V. atypica, V. denticariosi, V. dispar, V. parvula, V. rogosae, и V. tobetsuensis) у человека, как правило, обитают в ротовой полости. В литературе имеются данные о более высоком содержании Megasphaera spp. / Veilonella spp. / Dialister spp. во влагалище у пациенток, у которых впоследствии гистологически диагностирована легкая степень хороамнионита [27] при доношенной беременности; по данным других авторов [18, 22], у всех пациенток с ПРПО при недоношенной беременности были выявлены представители Megasphaera spp. / Veilonella spp. /Dialister spp. и Prevotella spp., причем второе исследование было проспективным, забор материала проводился пятикратно за время беременности, и во всех случаях ПРПО на фоне сниженного общего количества Lactobacillus spp. к моменту ПРПО в мазках выявлялись именно эти микроорганизмы.

В целом результаты сопоставимы с результатами М.А. Власовой и соавт. [4], которые в своей работе подчеркивают доминирующую роль анаэробных микроорганизмов в структуре дисбиоза женщин с ПРПО в сроке 26–34 нед. беременности.

Заключение

Наиболее прогностически значимые факторы риска развития ПРПО — дисбиоз влагалища, выявленный ПЦР-РВ; наиболее важные предикторы при исследовании микробиоты цервикального канала являются: количество Lactobacillus spp. менее 99,3 %; Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia /Porphyromonas spp. более 0,08 %; Megasphaera spp. / Veilonella spp. / Dialister spp. более 0,06 %.

About the authors

Maria A. Kaganova

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: mkaganova@yandex.ru

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Оbstetrics and Gynecology, IPE

Russian Federation, Samara

Natalya V. Spiridonova

Samara State Medical University

Email: nvspiridonova@mail.ru

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Obstetrics and Gynecology, IPE

Russian Federation, Samara

Viktoriya A. Petyanova

Samara City Clinical Hospital No. 1 named after N.I. Pirogov

Email: victoria.petianova@yandex.ru

Deputy Chief of the Hospital for Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Samara

Natalya G. Denisova

Samara City Clinical Hospital No. 1 named after N.I. Pirogov

Email: denisov_a_nata@mail.ru

Candidate of Medical Sciences, Head of the Obstetrics Department No. 20

Russian Federation, Samara

Svetlana V. Syresina

Samara City Clinical Hospital No. 1 named after N.I. Pirogov

Email: svetlana.syresina@yandex.ru

Head of the Obstetrics Department No. 21

Russian Federation, Samara

Maxim G. Petrov

Samara City Clinical Hospital No. 1 named after N.I. Pirogov

Email: svetlana.syresina@yandex.ru

Obstetrician of the Obstetrics Department No. 21

Russian Federation, Samara

Natalya A. Rodionova

Samara City Clinical Hospital No. 1 named after N.I. Pirogov

Email: natalyaarodionova@gmail.com

Obstetrician of the Obstetrics Department No. 20

Russian Federation, Samara

Luiza S. Inyusheva

Samara City Clinical Hospital No. 1 named after N.I. Pirogov

Email: luiza846@rambler.ru

Obstetrician of the Obstetrics Department No. 20

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files