Development and validation of a methodology for HPLC analysis of clopidogrel

Full Text

Список сокращений

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания; ИБС – ишемическая болезнь сердца; ВЭЖХ-УФ – высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектированием по абсорбции в ультрафиолетовой области спектра; ВЭЖХ-МС – высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрией; РСО – раствор стандартного образца.

ВВЕДЕНИЕ

Заболевания сердечно-сосудистой системы (ССЗ) (острый коронарный синдром, ишемический инсульт, транзиторная ишемическая атака, заболевания периферических артерий и др.) являются масштабной проблемой ХХI века [1, 2]. Более 50% населения Российской Федерации имеет патологию сердечно-сосудистой системы, которая влечет за собой смертельный исход [3, 4].

Наиболее актуальным и требующим особого внимания остается вопрос ишемической болезни сердца (ИБС). ИБС является ведущей причиной смертности в РФ и ряде других стран с 2002 года, а доля этого заболевания в общей смертности с каждым годом растет [5, 6, 7]. Согласно прогнозу ВОЗ, показатели смертности от ССЗ будут продолжать увеличиваться во всем мире [8]. В России высокий уровень смертности от ССЗ связан прежде всего с низким уровнем обращаемости больных в лечебные учреждения, особенно лиц пожилого и старческого возраста с ССЗ в анамнезе [9, 10].

ССЗ требуют медикаментозной коррекции. Клопидогрел – представитель антитромбоцитарных (антиагрегантных) средств, который эффективно применяется в комплексном лечении ССЗ и является препаратом антитромбоцитарной терапии для лечения больных СОVID-19 по рекомендациям Российского кардиологического общества (РКО) и Европейского общества кардиологов [11].

В условиях сильных ограничений во время пандемии СОVID-19 ухудшилось психоэмоциональное состояние людей, появилась тревожность, хронический стресс, депрессия [12]. Эпидемиологическая обстановка и психическое состояние привели к повышению уровня самоубийств. В качестве препарата для самоубийства неоднократно применялся именно клопидогрел [13]. По информации, приведенной в научной литературе за последние 10 лет, клопидогрел представляет интерес с точки зрения химико-токсикологических исследований, поскольку передозировка данным препаратом и смертельные случаи при его приеме встречаются достаточно часто [14–17]. Связано это в первую очередь с обострением основного заболевания у пациентов при неверном подборе препарата или вследствие резистентности к нему организма. Но также нередки случаи суицидов, совершенных посредством применения клопидогрела. При этом встречаются как моно-, так и поливалентные отравления [11, 18].

Развитие аналитической службы в направлениях проведения мониторинга эффективности лечения населения средствами, влияющими на свертывание крови и агрегацию тромбоцитов, и диагностики интоксикаций при применении этих лекарств базируется на разработке эффективных и экспрессных методик анализа препаратов в биологических объектах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Среди современных методов анализа для создания баз параметров идентификации и разделения массивов исследуемых веществ в биологических объектах ВЭЖХ-метод является одним из наиболее подходящих методов с высокой чувствительностью и селективностью.

ЦЕЛЬ

Разработка методики анализа клопидогрела с использованием ВЭЖХ для химико-токсикологического анализа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объект исследования – клопидогрель бисульфат (далее клопидогрел) – субстанция-порошок, производитель ЧАО «Фармак», Украина, соответствует Европейской фармакопее с содержанием действующего вещества 99,31% (серия LM2504208).

Реактивы соответствовали квалификации ЧДА: кислота хлористоводородная (37%) (Chimmed, Москва, Россия).

Аналитическое оборудование: хроматографический анализ был проведен на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», Россия), по унифицированной ВЭЖХ-методике, разработанной Г.И. Барамом [19].

Условия хроматографирования: колонка размером 2х75 мм с обращенной фазой С18 (ProntoSIL – 120 – 5 – C18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Германия); градиентное элюирование выполняется смешиванием двух элюентов: элюент А – [4 M LiClO₄ – 0,1 M HClO₄] – H₂O (5:95); элюент Б – ацетонитрил для ВЭЖХ; скорость подачи подвижной фазы – 100 мкл/мин; температура термостата колонки – 40ºС; объем вводимой пробы – 2 мкл. Детектирование проводили при восьми длинах волн: 210, 220, 230, 250, 260, 270, 280 и 300 нм.

Обработку хроматограмм и расчет V_R и S_λ / S₂₁₀ проводили с использованием компьютерной программы "МультиХром-СПЕКТР", версия 2.4 (ЗАО «Амперсенд»).

Приготовление элюента А. 0,2 М раствор литий перхлората в 0,005 М растворе кислоты хлороводородной готовили с использованием раствора 1 и раствора 2.

Раствор 1 (4,1 М водный раствор литий перхлората) получали растворением 330 г LiClO₄⋅3 H₂O в 450 мл бидистиллированной воде при перемешивании и нагреве до 50°C. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры и доводили бидистилированной водой до 500 мл. Раствор фильтровали сквозь мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Раствор 2 (4 М водный раствор LiClO₄ в 0,1 M HClO₄) готовили разведением 2,2 мл кислоты хлористоводородной до объема 250 мл раствором 1.

Элюент А готовили разведением 10 мл раствора 2 до 200 мл бидистилированной водой.

Приготовление раствора растворителя: в мерную колбу вместимостью 1000,0 мл вносили 500,00 мл 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной и доводили объем раствора водой очищенной до метки.

Приготовление стандартных растворов клопидогрела. 0,1000 г вещества вносили в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, растворяли в 10,00 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и доводили объем раствора водой очищенной до метки (стандартный раствор 1, концентрация 1000 мкг/мл).

В мерную колбу вместимостью 100,0 мл вносили 50,00 мл стандартного раствора 1 и доводили объем раствора водой очищенной до метки (стандартный раствор 2, концентрация 500 мкг/мл).

В мерную колбу вместимостью 100,0 мл вносили 20,00 мл стандартного раствора 2 и доводили объем раствора до метки растворителем (раствор 3, концентрация 100 мкг/мл).

В мерную колбу вместимостью 100,0 мл вносили 10,00 мл раствора 3 и доводили объем раствора до метки растворителем (раствор 4, концентрация 10 мкг/мл).

В две мерные колбы вместимостью 100,0 мл вносили по 10,00 и 5,00 мл раствора 4 соответственно и доводили объемы растворов до метки растворителем (растворы 5 и 6 соответственно; концентрация 1 и 0,5 мкг/мл).

Растворы клопидогрела 3, 4, 5 и 6 хроматографировали при вышеуказанных условиях. Предварительно проводили хроматографирование растворителя.

Для построения калибровочного графика для количественного определения клопидогрела методом ВЭЖХ готовили стандартный раствор клопидогрела в смеси 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной и воды (1:1).

0,1000 г клопидогрела вносили в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, растворяли в 10,00 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и доводили объем раствора водой очищенной до метки (стандартный раствор 1, концентрация 1000 мкг/мл).

В мерную колбу вместимостью 100,0 мл вносили 50,00 мл стандартного раствора 1 и доводили объем раствора водой очищенной до метки (стандартный раствор 2, концентрация 500 мкг/мл).

В три мерные колбы вместимостью 50,0 мл вносили 40,00; 20,00 и с 10,00 мл стандартного раствора 2 соответственно и доводили объемы растворов до метки растворителем (растворы 3, 4 и 5 соответственно, концентрация 400, 200 и 100 мкг/мл соответственно).

В мерную колбу вместимостью 100,0 мл вносили 10,00 мл стандартного раствора 2 и доводили объем раствора до метки растворителем (раствор 6, концентрация 50 мкг/мл). В мерную колбу вместимостью 100,0 мл вносили 10,00 мл раствора 5 и доводили объем раствора до метки растворителем (раствор 7, концентрация 10 мкг/мл). В мерную колбу вместимостью 100,0 мл вносили 10,00 мл раствора 7 и доводили объем раствора до метки растворителем (раствор 8, концентрация 1 мкг/мл).

Растворы клопидогрела 3, 4, 5, 6, 7 и 8 хроматографировали при вышеупомянутых условиях (рисунок 1). Хроматографию каждого раствора проводили трижды. По результатам эксперимента строили калибровочный график при длине волны 280 нм (рисунок 2). Для введения раствора препарата в хроматограф использовали автоматический пробозаборник, вводивший в хроматограф 2 мкл исследуемого раствора. Для работы использовали мерную посуду класса А (первого класса) и вспомогательные вещества, которые отвечали требованиям Государственной фармакопеи РФ XIV издания [20].

Перед проведением испытаний проводили проверку пригодности хроматографической системы: относительное стандартное отклонение для площадей пиков клопидогрела должно быть не более 5,0%; коэффициент асимметрии для пиков должен быть не более 2.

Специфичность методики оценивали по появлению одного пика, соответствующему клопидогрелу на хроматограмме. Идентификацию клопидогрела проводили по времени удерживания (tR) и по спектральным характеристикам – отношение площадей пиков при длинах волн λ₂-λ₈ к площади пика при длине волны λ₁ =210 нм (R = S_λ / S₂₁₀).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты приведены на рисунке 1. Значения tR, которые используются для идентификации пика вещества на хроматограмме, приведены в таблице 1.

 

Рисунок 1. Хроматограмма клопидогрела (концентрация 10 мкг/мл).

Figure 1. Chromatogram of clopidogrel (concentration 10 μg/ml).

 

Таблица 1. Результаты определения основных хроматографических параметров

Table 1. Results of determination of the main chromatographic parameters

Параметр		Значение параметра	Метрологические характеристики (n=3, Р =0,95)
			$\overline{X}$	SD	RSD, ±%	S$\overline{x}$	∆$\overline{X}$	ε, ±%
Время удерживания (tR), мин		13,741	13,738	0,048	0,35	0,2073	0,89	1,16
		13,784
		13,689
Спектральное соотношение (R = Sλ / S210)	210 нм 210 нм	1,0000	1,0000	0	0	0	0	0
		1,0000
		1,0000
	220 нм 210 нм	0,9831	0,9741	0,009	0,93	0,2203	0,95	9,7
		0,9742
		0,9649
	230 нм 210 нм	0,6383	0,6483	0,009	1,36	0,2073	0,9	1,37
		0,6517
		0,6549
	240 нм 210 нм	0,2167	0,2203	0,004	1,79	0,1884	0,81	3,67
		0,2196
		0,2245
	250 нм 210 нм	0,2058	0,2044	0,005	2,54	0,2203	0,95	4,63
		0,1986
		0,2087
	260 нм 210 нм	0,2801	0,2811	0,006	2,07	0,2074	0,89	3,17
		0,2873
		0,2758
	280 нм 210 нм	1,0756	1,0787	0,003	0,28	0,1884	0,81	1,05
		1,0789
		1,0817
	300 нм 210 нм	0,6231	0,6248	0,005	0,76	0,2203	0,95	1,51
		0,6211
		0,6301

 

Как видно из полученных данных, время удерживания пика клопидогрела составляет около 13,74 мин.

Минимальная концентрация клопидогрела в растворе, которую можно определить с помощью приведенной методики, составляет 1 мкг/мл, что соответствует содержанию вещества в пробе 2 нг.

Наиболее высокое спектральное отношение 280 нм / 210 нм (максимальная площадь пика клопидогрела R = 1,0787), что и было использовано для дальнейшего количественного определения клопидогрела.

Количественное определение клопидогрела методом ВЭЖХ-УФ проводили при λ = 280 нм, что соответствовало области максимального специфического светопоглощения клопидогрела в УФ – области спектра, применяя при этом метод абсолютной калибровки. Результат приведен в таблице 2.

 

Таблица 2. Зависимость площади пика растворов клопидогрела от концентрации его растворов (λ = 280 нм; объем пробы 2 мкл)

Table 2. The dependence of the peak area of clopidogrel solutions on the concentration of its solutions (λ = 280 nm; sample volume 2 µl)

Концентрация раствора клопидогрела, мкг/мл	Площадь пика
	Sі	$\overline{S}$	RSD, ±%
1,0	0,0004330	0,0004388	2,20
	0,0004500
	0,0004330
10,0	0,004897	0,004753	4,06
	0,004533
	0,004827
50,0	0,02805	0,02810	0,31
	0,02820
	0,02805
100,0	0,05682	0,05635	1,35
	0,05675
	0,05547
200,0	0,1184	0,1162	2,57
	0,1128
	0,1174
400,0	0,2374	0,2358	1,09
	0,2328
	0,2371

 

По полученным результатам, приведенным в таблице 2, строили калибровочный график (рисунок 2). Результаты свидетельствуют, что линейная зависимость при количественном определении исследуемого вещества методом ВЭЖХ наблюдается в пределах концентраций от 1 до 400 мкг/мл.

 

Рисунок 2. Калибровочный график количественного определения клопидогрела методом ВЭЖХ (λ=280 нм, объем пробы 2 мкл).

Figure 2. A calibration curve of the quantitative determination of clopidogrel by HPLC (λ=280 nm, sample volume 2 µl).

 

Методика количественного определения линейна в пределах 1−400 мкг/мл, что соответствует содержанию клопидогрела в пробе от 2 нг до 800 нг соответственно. На основании величин калибровочной прямой было рассчитано значение LOD и LOQ с использованием стандартного отклонения перехвата (Sa) в соответствии со следующими уравнениями [21]:

 

$LOD=3,3\frac{S_a^2}{b}$

$LOQ=10\frac{S_a^2}{b}$

Они составляли 2,334 мкг/мл и 7,074 мкг/мл соответственно.

Оценка правильности метода определялась при трех уровнях концентрации (таблица 3) [21]. Для этого нами были выбраны: нижний уровень концентраций – 10,0 мкг/мл; средний – 200,0 мкг/мл и высокий – 400,0 мкг/мл.

 

Таблица 3. Оценка правильности методики определения клопидогрела с помощью унифицированной ВЭЖХ методики

Table 3. An assessment of the correctness of the methodology for determining clopidogrel using the unified HPLC methodology

Уровень	Внесено мкг/мл	Найдено клопидогреля		Метрологическая характеристика
		Мкг/мл	R, %
1	10,0	10,11	101,10	$\overline{X}$ =99,69 SD=2,93 RSD= ± 2,94% ∆$\overline{X}$ =1,31 ε= ± 1,31%
		9,98	99,80
		10,01	100,10
2	200,0	194,6	97,30
		200,1	100,05
		200,4	100,20
3	400,0	400,1	100,02
		398,4	99,60
		396,2	99,05

 

Полученные данные свидетельствуют о том, что значения, принимаемые за истинные, находятся внутри доверительного интервала среднего результата анализа, полученного экспериментально.

По результатам метрологических характеристик проведена проверка наличия значимой системной погрешности [21]. В результате расчета установлено, что критерий Стьюдента составил t=1,57, что не превышает табличного значения 1,57 < 2,776, поэтому можно сделать вывод об отсутствии систематической ошибки.

Определение прецизионности проводили на концентрации раствора 100 мкг/мл (таблица 4).

 

Таблица 4. Оценка прецизионности определения клопидогрела методом ВЭЖХ

Table 4. The evaluation of the precision of clopidogrel determination by HPLC

Внесено, мкг/мл	Площадь пика, отн. ед.	Результат, мкг	(Xi-$\overline{X}$)	(Xi-$\overline{X}$)2	Метрологическая характеристика (n = 6; P = 0,95)
100	0,05747	100,7	0,43	0,1849	$\overline{X}$ =100,27 SD = 1,22 RSD = ±1,22%
	0,05743	99,7	-0,57	0,3249
	0,05749	101,0	0,73	0,5329
	0,05745	100,3	0,07	0,0009
	0,05741	99,6	-0,67	0,4489
	0,05745	100,3	0,07	0,0009

 

Так как RSD не превышает допустимых норм, предлагаемая методика является прецизионной. Из приведенных данных мы видим, что разработанная методика отвечает всем валидационным требованиям и может быть использована для целей химико-токсикологического анализа клопидогрела.

Литературные данные свидетельствуют о том, что метод ВЭЖХ очень часто используется как для анализа лекарственных веществ в лекарственных формах, так и для их анализа в биологических жидкостях, а также для изучения фармакокинетики. Так, ВЭЖХ-методика предлагалась для анализа клопидогрела в таблетках [22–24], для определения примесей в лекарственных формах клопидогрела [25–27], для определения клопидогрела в плазме крови и моче с помощью методов ВЭЖХ [27, 28], ВЭЖХ-МС [29]. Идентификация и количественное определение исследуемого лекарственного средства в лекарственных формах методом ВЭЖХ были проведены в различных условиях хроматографирования.

Предложенные методики анализа клопидогрела методом ВЭЖХ имеют недостатки. Использование изократического режима элюирования ограничивает возможность выхода всех компонентов образца из колонки в узких зонах и эффективное распределение смесей лекарственных препаратов. Применение нелинейного градиента при элюировании клопидогрела усложняет процесс хроматографии. Определение лекарственного вещества при одной длине волны снижает достоверность результатов, полученных при идентификации, поскольку позволяет использовать только параметры удерживания без учета спектральных соотношений.

Таким образом, современные методики анализа клопидогрела с помощью ВЭЖХ указывают на отсутствие систематических исследований, что не позволяет использовать их для целей химико-токсикологического анализа.

Градиентное элюирование смесями растворителей в нашем методе представляет собой линейный градиент от элюента A (5% ацетонитрил и 95% буфер) до элюента B (100% ацетонитрил). Метод самого быстрого режима обеспечивал уменьшение полярности элюента с добавлением менее полярного растворителя (ацетонитрила) и снижение удерживания компонентов, тем самым создавая условия для выхода из колонки всех компонентов образца в виде узких зон. Термостат колонки твердотельного типа с электронагревателем обеспечивал оптимальные условия хроматографии и воспроизводимость результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработана методика количественного определения клопидогрела методом ВЭЖХ, которая позволяет определять его в смеси. Проведена валидация методики по показателям: специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, правильность и прецизионность.

Сравнительная оценка спектральных соотношений позволяет получать более надежные и воспроизводимые результаты, а также идентифицировать препараты с близкими значениями параметров удерживания.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Ludmila S. Anosova

Donetsk National Medical University named after M. Gorky

Author for correspondence.
Email: Apteka-NaNya@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9380-4619

Assistant of the Department of Pharmaceutical and Medical Chemistry

Russian Federation, Donetsk

Irina P. Remezova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute – branch of the Volgograd State Medical University

Email: i.p.remezova@pmedpharm.ru
ORCID iD: 0000-0003-3456-8553

PhD, Professor, Department of Toxicological and Analytical Chemistry

Russian Federation, Pyatigorsk

Alexey M. Agafonov

Donetsk National Medical University named after M. Gorky

Email: Chuh2008@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0682-1366

Assistant of the Department of Pharmaceutical and Medical Chemistry

Russian Federation, Donetsk

References

Supplementary files