THE DEVELOPMENT OF APPROACHES TO STANDARDIZATION OF THE POPULUS NIGRA LEAVES

Full Text

Введение Тополь черный (Populus nigra L.) является одним из фармакопейных видов растений, включенных в Государственную фармакопею Российской Федерации XIII издания: в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС) зарегистрированы почки (ФС.2.5.0042.15) [2]. Препараты на основе почек тополя обладают широким спектром фармакологической активности: противогрибковым, антисептическим, ранозаживляющим и противовоспалительным действием [1, 3-5]. На наш взгляд, не менее интересными с точки зрения источника биологически активных соединений (БАС) являются и другие части растения, в том числе листья тополя черного. Известен опыт народного применения листьев тополя в качестве средства, обладающего противовоспалительными и антибактериальными свойствами, однако в настоящее время степень изученности химического состава данного вида сырья является недостаточной. С целью введения листьев тополя черного в Государственную фармакопею Российской Федерации необходимо проведение комплекса фармакогностических исследований, включая разработку нормативной документации, подтверждающей качество ЛРС [7]. Цель настоящего исследования - разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного. В задачи исследования входило: - разработка методики количественного анализа суммы флавоноидов в листьях тополя черного; - определение содержания суммы флавоноидов для изучаемого вида сырья; - определение нижнего предела содержания действующих веществ для листьев тополя черного. Результаты и их обсуждение Тополь черный - Populus nigra L., быстро растущее, широко распространенное растение на территории Российской Федерации [5]. Особый интерес наряду с фармакопейным сырьем - почками представляют листья данного растения. Так, в листьях тополя черного содержатся фенольные соединения, витамины, органические кислоты, дубильные вещества [6]. Объектом исследования служили листья тополя черного, заготовленные в июне и сентябре 2012-2018 гг. в п. Алексеевка и с. Гаврилова Поляна Самарской области. В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного изучены УФ-спектры растворов водно-спиртовых извлечений из данного сырья (рис. 1 и 2). Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения тополя черного наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (рис. 1), как и в случае рутина (рис. 3). Изучение УФ-спектров Государственного стандартного образца (ГСО) рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 414 нм (рис. 3). В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного в дифференциальном варианте обнаруживается при длине волны 414 нм максимум поглощения (рис. 4), который соответствует максимуму поглощения раствора рутина. Таким образом, рутин может быть использован в методике анализа в качестве ГСО. С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов нами подобраны оптимальные условия экстракции флавоноидов в листьях тополя черного: экстрагент 70 % этиловый спирт; соотношение «сырье - экстрагент» - 1 : 30; время экстракции - извлечение на кипящей водяной бане в течение 60 мин (табл. 1). Методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 414 нм через 40 минут после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1 : 30) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96 % до метки. Примечание: Приготовление раствора рутина - стандартного образца. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70 % этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70 % этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б рутина). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 414 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (раствор сравнения Б рутина). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: , где D - оптическая плотность испытуемого раствора; Do - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m - масса сырья, г; mo - масса ГСО рутина, г; W - потеря в массе при высушивании в процентах. В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения - 240. , где D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - масса сырья, г; 240 - удельный показатель поглощения () ГСО рутина при 414 нм; W - потеря в массе при высушивании в процентах. Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в листьях тополя черного представлены в табл. 2. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного с доверительной вероятностью 95 % составляет ±3,21 %. Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов листьев тополя черного и рутина с алюминия хлоридом. Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,00880 до 0,03520 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,98953. Правильность методики определяли методом добавок путем добавления раствора рутина с известной концентрацией (25, 50 и 75 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 98 %. С использованием разработанной методики нами проанализирован ряд образцов листьев тополя черного (табл. 3) и при этом определено, что содержание суммы флавоноидов варьирует от 2,04 до 2,99 %, что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела для сырья данного растения содержание суммы флавоноидов не менее 2,0 %. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности стандартизации листьев тополя черного путем определения суммы флавоноидов методом спектрофотометрии при аналитической длине волны 414 нм в пересчете на рутин. Выводы 1. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина при аналитической длине волны 414 нм. 2. Содержание суммы флавоноидов для листьев тополя черного варьирует от 2,04 до 2,99 %. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет ±3,21 %. 3. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для листьев тополя черного нижний предел содержания суммы флавоноидов не менее 2,0 %. Конфликт интересов отсутствует. [A] 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 350 1 400 2 450 [nm] Рис. 1. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного: 1 - раствор извлечения; 2 - раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида Fig. 1. Electronic spectra of solutions of water-alcohol extraction from Populus nigra leaves: 1 - extraction solution; 2 - extraction solution with aluminium chloride [A] 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 1 350 400 2 450 [nm] Рис. 2. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного: 1 - раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида; 2 - раствор рутина с добавлением алюминия хлорида Fig. 2. Electronic spectra of solutions of water-alcohol extraction from Populus nigra leaves: 1 - extraction solution with aluminium chloride; 2 - rutin solution with aluminium chloride [A] 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 350 1 400 2 450 [nm] Рис. 3. Электронные спектры спиртовых растворов рутина: 1 - исходный раствор; 2 - раствор с добавлением алюминия хлорида Fig. 3. Electronic spectra of alcohol solutions of rutin: 1 - primary solution; 2 - solution with aluminium chloride Таблица 1 / Table 1 Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из листьев тополя черного The dependence of the efficiency of extraction of the total flavonoids from the leaves of the Populus nigra № п/п Экстрагент Соотношение сырье : экстрагент Время экстракции, мин Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье (в %) 1 40 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,71 ± 0,11 2 50 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,79 ± 0,08 3 60 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,92 ± 0,09 4 70 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,99 ± 0,08 5 80 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,89 ± 0,12 6 96 % этиловый спирт 1 : 30 60 0,85 ± 0,10 7 70 % этиловый спирт 1 : 30 30 2,52 ± 0,07 9 70 % этиловый спирт 1 : 30 45 2,62 ± 0,08 12 70 % этиловый спирт 1 : 30 90 2,69 ± 0,09 14 70 % этиловый спирт 1 : 30 120 2,88 ± 0,09 15 70 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,74 ± 0,08 16 70 % этиловый спирт 1 : 20 60 2,68 ± 0,07 17 70 % этиловый спирт 1 : 50 60 2,47 ± 0,08 [A] 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 350 400 450 [nm] Рис. 4. Электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного (дифференциальный вариант) Fig. 4. The electronic spectrum of a solution of water-alcohol extraction of the leaves of Populus nigra (differential version) Таблица 2 / Table 2 Mетрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного Metrological characteristics of methods for the quantitative determination of the total flavonoids in the leaves of the Populus nigra f ‾X S P, % t (P, f) ±X E, % 10 2,83 0,4472 95 2,23 ±0,091 ±3,21 Таблица 3 / Table 3 Cодержание суммы флавоноидов в образцах листьев тополя черного The content of the total flavonoids in samples of Populus nigra leaves № п/п Характеристика образца сырья Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (в %) в пересчете на рутин 1 Самарская область, п. Алексеевка (июнь 2012 г.) 2,99 ± 0,11 2 Самарская область, п. Алексеевка (июнь 2017 г.) 2,87 ± 0,08 3 Самарская область, с. Гаврилова Поляна (сентябрь 2018 г.) 2,04 ± 0,09

About the authors

E A Kupriyanova

Samara State Medical University

Email: lenoka-09@mail.ru
Postgraduate student, Department of Pharmacognosy with Botany and the Basics of Phytotherapy

V A Kurkin

Samara State Medical University

Email: kurkinvladimir@yandex.ru
Doctor of Pharmacy, Professor, Head of the Department of Pharmacognosy with Botany and the Basics of Phytotherapy

References

Supplementary files