Идентификация бетулина в коре осины обыкновенной методом жидкостной хроматографии

Полный текст

Осина обыкновенная (Populus tremula L.) — представитель семейства ивовых (Salicaceae), широко произрастает на территории Республики Беларусь.

В реестре лекарственных препаратов Республики Беларусь нет зарегистрированных растительных препаратов на основе лекарственного растительного сырья осины обыкновенной.

В Единый реестр свидетельств о государственной регистрации единой нормативно-справочной информации Евразийского экономического союза включены биологически активные добавки к пище, содержащие кору осины. Все они производятся фармацевтическими предприятиями Российской Федерации [1].

В связи с необходимостью расширения номенклатуры отечественных препаратов на основе лекарственного растительного сырья актуальна разработка лекарственных растительных препаратов и биологически активных добавок к пище на основе коры осины обыкновенной.

В соответствии с Руководством по качеству лекарственных растительных препаратов для оценки качества растительных препаратов используют активные или аналитические маркеры, которые служат для расчета количества лекарственного растительного сырья или препаратов на основе лекарственного растительного сырья в готовом растительном препарате [2].

Для лекарственного растительного сырья, в отношении которого отсутствует информация о составляющих компонентах, ответственных за терапевтическую активность, неободимо проводить количественнное определение активных или аналитически маркеров. Целессобразность выбора маркеров должна быть обоснована экспериментальными и научными данными [3].

Ранее методом тонкослойной хроматографии нами был проведен скрининг основных групп биологически активных веществ, входящих в состав коры осины, и обнаружена мажоритарная группа биологически активных веществ – тритерпеновые сапонины. В ходе скрининга нами было обнаружено вещество, которое относится к группе пентациклических тритерпеновых сапонинов производных лупана — бетулин.

Рекомендована стандартизация коры осины обыкновенной по сумме тритерпеновых сапонинов, а также обнаружение и идентификация бетулина как аналитического маркера мажоритарной группы биологически активных веществ коры осины обыкновенной методом тонкослойной хроматографии.

Бетулин, а также его производные, выделенные из растительных объектов, обладают доказанными антиоксидантными [4], гастропротекторными, противоязвенными, капилляроукрепляющими [5], противовирусными и противоопухолевыми свойствами [6]. Поэтому бетулин может выступать в роли активного маркера ( компонента, который вносит вклад в терапевтическую активность) и использоваться при стандартизации растительных перпаратов на основе коры осины.

Цель нашей работы – проведение скрининга биологически активных веществ коры осины обыкновенной, обнаружение и идентификация бетулина в коре осины обыкновенной методом жидкостной хроматографии.

Материалы и методы.

Объектом исследования являются образцы коры осины обыкновенной, заготовленные в 2024 году на территории Республики Беларусь, высушенные методом воздушно-теневой сушки и измельченные на универсальной мельнице VLM-6 до грубого порошка с частицами размером 1400 мкм (не менее 96% порошка проходит через сито с размером отверстий 1400 мкм) [7].

Скрининг биологически активных веществ.

Качественный анализ на кумарины, флавоноиды и сапонины проводили с помощью качественных химических реакций на указанные группы биологически активных веществ.

Для качественного обнаружения кумаринов получали спиртовое (95% этанол) извлечение коры осины обыкновенной в соотношении сырье:экстрагент 1:10 в условиях нагревания с обратным холодильником на водяной бане в течение 15-20 минут.

Для качественного обнаружения флавоноидов получали спиртовое (70% этанол) извлечение коры осины обыкновенной в соотношении сырье:экстрагент 1:15 в условиях нагревания с обратным холодильником на водяной бане в течение 15-20 минут.

Для качественного обнаружения сапонинов получали водное извлечение и извлечение на изотоническом растворе хлорида натрия коры осины обыкновенной в соотношении сырье:экстрагент 1:20 в условиях нагревания с обратным холодильником на водяной бане в течение 10 минут.

Для качественного обнаружения фенольных соединений получали водное извлечение коры осины обыкновенной в соотношении сырье:экстрагент 1:50 в условиях нагревания с обратным холодильником на водяной бане в течение 10 минут.

 

Методика обнаружения, идентификации и количественного определенеия бетулина методом жидкостной хроматографии.

В работе использовали валидированную методику, описанную в источнике [8]. Хроматографирование проводили на жидкостном хроматографе марки UltiMate 3000, оснащенном диодно-матричным детектором. Для разделения компонентов использовали колонку ACE Equivalence С18 длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную октадецилсилильным силикагелем для хроматографии с размером частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил-вода 90:10 (об/об) в изократическом режиме. Скорость подвижной фазы составила 1,0 мл/мин, температура колонки – 40°С. Объем вводимой пробы – 20 мкл. Детектирование проводили при длине волны 206 нм. Время анализа составляло около 20 мин.

В работе использовали ацетонитрил (HPLC, Thermo Fisher scientific, кат. № P300000GMPDM55M), спирт этиловый 96%, стандартный образец бетулина (Glentham Life Sciences, кат. № GP5633).

Спиртовое извлечение коры осины обыкновенной получали путем нагревания до кипения лекарственного растительного сырья с 70% спиртом этиловым в колбе с обратным холодильником в течение 30 минут в соотношении 1:10 (м/об). Время отсчета экстракции отсчитывали от момента закипания экстрагента.

Извлечение и очистку фракции бетулина проводили в соответствии с методикой, описанной в работе [3]. Для этого проводили экстракцию коры осины спиртом бутиловым с последующей очисткой щелочным гидролизом при нагревании в течение 3 часов.

Раствор сравнения готовили путем растворения около 0,010 г стандартного образца в спирте этиловом 96%.

Содержание бетулина (X, %) в коре осины рассчитывали по формуле:

 

 

где:

S – площадь основного хроматографического пика на хроматограмме испытуемого раствора (спиртовое извлечение);

S₀ – площадь хроматографического пика бетулина на хроматограмме раствора сравнения;

V_э – объем экстрагента, мл;

m – масса сырья, использованного для приготовления спиртового извлечения, г;

g₀ – масса навески стандартного образца, г;

P – чистота стандартного образца, %.

 

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета анализа данных программы Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение.

Результаты качественного химического анализа образцов коры осины обыкновенной на наличие кумаринов, флавоноидов и сапоннов приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Результаты качественного химического анализа биологически активных веществ коры осины обыкновенной.

Table 1 – Results of qualitative chemical analysis of biologically active substances of common aspen bark.

 

Методика качественной реакции	Ожидаемый результат	Наблюдаемый аналитический эффект
Кумарины
Лактонная проба В 2 пробирки наливают по 2 мл спиртового извлечения и прибавляют по 0,5 мл 10 % спиртового раствора гидроксида натрия. Одну пробирку нагревают на спиртовке до кипения и охлаждают, другую - оставляют без нагревания. В каждую пробирку приливают по 4 мл воды очищенной. Раствор, полученный при нагревании с 10 % гидроксидом натрия, разливают на 2 части. Первую половину раствора подкисляют несколькими каплями хлороводородной кислоты (концентрированной)	В случае присутствия в исследуемой пробе кумаринов нагревание с 10 % спиртовым раствором гидроксида натрия приводит к появлению жёлтого окрашивания (растворимые соли кумаровой кислоты). После подкисления испытуемого раствора несколькими каплями хлороводородной кислоты (концентрированной) происходит выпадение  осадка (нерастворимые кумарины)	При нагревании испытуемого раствора с 10 % спиртовым раствором гидроксида натрия наблюдали появление жёлтого окрашивания. При подкислении несколькими каплями хлороводородной кислоты (концентрированной) наблюдали выпадение осадка
Диазореакция Ко второй половине раствора, полученного при нагревании с 10 % раствором гидроксида натрия, приливают 2-3 капли свежеприготовленного раствора диазотированной сульфаниловой кислоты (диазореактив)	В случае присутствия в исследуемой пробе кумаринов (раскрытого лактонного кольца) появляется вишнево-бурое окрашивание раствора	Вишнёво-бурое окрашивание раствора
Флавоноиды
Цианидиновая проба по Шиноду К 1 мл спиртового извлечения прибавляют 3-4 капли хлороводородной кислоты (концентрированной) и 10-15 г (2 гранулы) металлического цинка, после чего нагревают на кипящей водяной бане	В случае присутствия в исследуемой пробе флавоноидов раствор приобретает розовое окрашивание	Розовое окрашивание испытуемого раствора
Цианидиновая проба по Брианту К испытуемому раствору цинадиновой пробы по Шиноду прибавляют н-бутанол и воду до разделения фаз, встряхивают	В случае присутствия в исследуемой пробе флавоноидов в форме агликонов окрашивание переходит в органическую фазу. В случае присутствия в исследуемой пробе флавоноидов в форме гликозидов окрашивание сохраняется в водной фазе. В случае присутствия в исследуемой пробе флавоноидов в двух формах (агликоны и гликозиды) наблюдают окрашивание обеих фаз	Розовое окрашивание  органической фазы
Реакция с раствором щелочи К 1 мл спиртового извлечения добавляют 2-3 капли 5 % спиртового раствора гидроксида натрия	В случае присутствия в исследуемой пробе флавоноидов раствор приобретает окрашивание от жёлтого до коричневого	Красно-оранжевое окрашивание раствора
Реакция комплексообразования с раствором хлорида алюминия К 1 мл спиртового извлечения добавляют 2-3 капли 2% спиртового раствора хлорида алюминия	В случае присутствия в исследуемой пробе флавоноидов раствор приобретает желтое окрашивание, флуоресцирующее зеленовато-желтым цветом на границе «раствор-воздух» в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм	Желтое окрашивание раствора Зеленовато-желтая флуоресценция в ультрафиолетовом свете (365 нм) на границе «раствор-воздух» при взбалтывании
Реакция осаждения раствором основного ацетата свинца К 1 мл спиртового извлечения добавляют 3-5 капель раствора основного ацетата свинца	В случае присутствия в исследуемой пробе флавоноидов наблюдают выпадение жёлтого осадка	Жёлтый осадок
Сапонины
Гемолиз эритроцитов К 1 мл извлечения на изотоническом растворе хлорида натрия добавляют 1 мл 2% взвеси эритроцитов в изотоническом растворе хлорида натрия	В случае присутствия в исследуемой пробе сапонинов наблюдают образование лаковой крови (прозрачное ярко-красное окрашивание)	Лаковая кровь (прозрачное ярко-красное окрашивание)
Реакция пенообразования В 2 пробирки одинакового диаметра и высоты вносят по 0,5 мл водного извлечения. В одну пробирку добавляют 1 мл 0,1н раствора хлороводородной кислоты, в другую – 1 мл 0,1н раствора гидроксида натрия. Затеи пробирки одновременно сильно встряхивают	В случае присутствия в исследуемой пробе тритерпеновых сапонинов наблюдают в обеих пробирках столбики пены, равные по стойкости и объему. В случае присутствия в исследуемой пробе стероидных сапонинов наблюдают в обеих пробирках столбики пены, не равные по стойкости и объему. В пробирке с 1 мл 0,1н раствора гидроксида натрия столбик пены больше, по сравнению с пробиркой с 1 мл 0,1н раствора хлороводородной кислоты	В обеих пробирках столбики пены, равные по стойкости и объему
Реакция осаждения раствором среднего ацетата свинца К 1 мл водного извлечения добавляют 3 капли раствора среднего ацетата свинца	В случае присутствия в исследуемой пробе тритерпеновых сапонинов наблюдают выпадение жёлтого осадка	Жёлтый осадок
Реакция осаждения раствором основного ацетата свинца К 1 мл водного извлечения добавляют 3 капли раствора основного ацетата свинца	В случае присутствия в исследуемой пробе стероидных сапонинов наблюдают выпадение жёлтого осадка	Выпадение жёлтого осадка отсутствует
Фенольные соединения
Реакция с фосфорномолибденововольфрамовым реактивом К 2 мл водного извлечения добавляют 1 мл раствора фосфорномолибденововольфрамового реактива в среде раствора 290 г/л натрия карбоната	В случае присутствия в исследуемой пробе фенольных соединений наблюдают синее окрашивание	Синее окрашивание раствора
Реакция с 4-(N,N-диметиламино)коричным альдегидом К 0,1 мл водного извлечения добавляют 0,5 мл спиртового раствора 20 г/л 4-(N,N-диметиламино)коричного альдегида, предварительно смешанного 1:1 со спиртовым раствором 6N серной кислоты	В случае присутствия в исследуемой пробе конденсированных дубильных веществ (проантоцианидинов) наблюдают зеленое окрашивание	Зеленое окрашивание раствора
Реакция с железоаммонийными квасцами К 2 мл водного извлечения добавляют 4 капли 1% раствора железоаммонийных квасцов	В случае присутствия в исследуемой пробе конденсированных дубильных веществ (проантоцианидинов) наблюдают зеленое окрашивание. В случае присутствия в исследуемой пробе гидролизуемых дубильных веществ наблюдают синее окрашивание.	Зеленое окрашивание раствора
Реакция с раствором ванилина К 2 мл водного извлечения добавляют 2 мл 1 г/л раствора ванилина и 1 мл 10 г/л раствора серной кислоты	В случае присутствия в исследуемой пробе мономерных единиц дубильных веществ (катехинов) наблюдают красное окрашивание	Красное окрашивание раствора

 

Методом качественного химического анализа в образцах коры осины обыкновенной обнаружены кумарины, флавоноиды, тритерпеновые сапонины и фенольные соединения.

 

Типичные хроматограммы и спектры раствора стандартного образца бетулина, спиртового извлечения коры осины обыкновенной, выделенной и очищенной фракции бетулина приведены на рисунках 1-3.

На всех хроматограммах обнаружены пики со временем удерживания около 7,5 минут, обладающие подобными спектральными характеристиками. Это позволяет сделать вывод, что в спиртовом извлечении коры осины обыкновенной и в выделенной, очищенной фракции содержатся значительные количества бетулина.

 

Рисунок 1. – Хроматограмма раствора стандартного образца бетулина

Figure 1. Chromatogram of a solution of a standard sample of betulin

 

Рисунок 2. – Хроматограмма спиртового извлечения из коры осины обыкновенной

Figure 2. – Chromatogram of alcohol extraction from the bark of aspen

 

Рисунок 3. – Хроматограмма очищенной фракции бетулина из коры осины обыкновенной

Figure 3. – Chromatogram of the purified betulin fraction from the bark of aspen

Содержание бетулина в спиртовом извлечении (n=3) составило 0,77±0,04%.

Таким образом, экспериментально обоснована целесообразность выбора бетулина в качестве аналитического маркера для расчета количества лекарственного растительного сырья.

Другие соизвлекаемые биологически активные вещества не затрудняют обнаружение аналитического маркера, что не будет обусловливать определенные трудности при проведении оценки подлинности (идентификации) и качества лекарственного растительного сырья, а также лекарственных растительных препаратов из коры осины обыкновенной.

Подлинность коры осины обыкновенной в виде испытаний на идентификацию (подлинность) бетулина специфична для данного вида лекарственного растительного сырья. Приемлемым считается использование хроматографических методик испытаний на идентификацию (подлинность) бетулина в комбинации методами жидкостной и тонкослойной хроматографии.

Для расчета количества лекарственного растительного сырья или препаратов на основе лекарственного растительного сырья в готовом растительном препарате требуется разработка и валидация методики количественого определения бетулина в коре осины обыкновенной с учетом многофакторного параметрического моделирования процесса экстракции бетулина из коры осины обыкновенной.

Заключение.

1. Методом качественного химического анализа в коре осины обыкновенной обнаружены кумарины, флавоноиды, тритерпеновые сапонины и фенольные соединения.
2. Методом жидкостной хроматографии в коре осины обыкновенной обнаружен и идентифицирован бетулин.
3. Бетулин рекомендован в качестве аналитического маркера при идентификации коры осины обыкновенной методом жидкостной хроматографии.
4. Показана перспективность применения жидкостной хроматографии для идентификации и оценки степени очистки бетулина при его выделении из коры осины обыкновенной.

 

Об авторах

Ольга Александровна Ёршик

Белорусский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: Olgavgmugnoz@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-9977-7464
https://www.bsmu.by/personalii/ershik-olga-aleksandrovna-/

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры организации фармации  с курсом повышения квалификации и переподготовки

Белоруссия

Ольга Владимировна Мушкина

Белорусский государственный медицинский университет

Email: olga7081@tut.by
ORCID iD: 0000-0002-3397-1220
SPIN-код: 4264-6457
Scopus Author ID: 1103760
ResearcherId: 1103760
https://www.bsmu.by/personalii/mushkina-olga-vladimirovna-/

к.фарм.н., доцент, заведующий кафедрой организации фармации с курсом повышения квалификации и переподготовки

Белоруссия, 2200045, Беларусь, г. Минск, пр-т Дзержинского, д. 83.

Александр Юрьевич Фисюк

Белорусский государственный медицинский университет

Email: a.fisiuk@yandex.bu
ORCID iD: 0009-0007-6220-514X
https://www.bsmu.by/personalii/fisyuk-aleksandr-yurevich/

преподаватель-стажёр кафедры организации фармации с курсом повышения квалификации и переподготовки

Белоруссия, 2200045, Беларусь, г. Минск, пр-т Дзержинского, д. 83.

Список литературы

Дополнительные файлы