Актуальные вопросы стандартизации корней солодки

Полный текст

Обоснование

Солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.) и солодка уральская (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) широко применяют в официальной медицине для получения лекарственных препаратов, обладающих обширным спектром фармакологической активности [4–7]. Фармакопейным сырьем для обоих видов растений служат корни [6]. Препараты на основе корней солодки (экстракты густой и сухой, солодки сироп, многокомпонентные растительные сборы, бальзамы, «Грудной эликсир» и др.) применяются в качестве противовоспалительных, отхаркивающих, антигистаминных, иммуномодулирующих, противоязвенных средств [3].

Основными биологически активными соединениями сырья и препаратов солодки голой и солодки уральской являются тритерпеновые сапонины (глицирризиновая кислота) и флавоноиды (ликуразид) (рис. 1, 2) [1, 4–7].

 

Рис. 1. Структурная формула глицирризиновой кислоты / Fig. 1. Structural formula of glycyrrhizic acid

 

Рис. 2. Структурная формула ликуразида / Fig. 2. Structural formula of licuraside

 

В настоящее время качество корней солодки оценивается по содержанию глицирризиновой кислоты, для количественного определения которой в сырье и лекарственных препаратах в России традиционно используют метод спектрофотомерии [2, 6]. В действующей фармакопейной статье «Солодки корни» (ФС.2.5.0040.15) для количественного определения этого биологически активного соединения применяют многостадийную методику, предусматривающую экстракцию сырья азотной кислоты 3 % ацетоновым раствором, добавление к полученному экстракту концентрированного раствора аммиака до появления светло-желтого творожистого осадка, фильтрование и растворение в воде полученного осадка с последующим спектрофотометрическим определением глицирризиновой кислоты при аналитической длине волны 258 нм [2].

В то же время внедрение тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), ЯМР-спектроскопии и других методов в область фармации открыло новые возможности для совершенствования стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов. В научной литературе опубликованы нефармакопейные методики определения глицирризиновой кислоты в сырье и препаратах солодки с использованием методов ВЭЖХ, капиллярного электрофореза [8–14]. Известна методика определения этого соединения методом микроколоночной ВЭЖХ. Экстракцию проводят 50 % этанолом в ультразвуковой ванне с последующим хроматографическим разделением с использованием в качестве подвижной фазы градиентной системы [4,1 М LiClO₄ в 0,1 М НClO₄ (элюент А) — ацетонитрил (элюент В); режим элюирования 10–60 % элюента В (0–5 мин)]. Температура колонки 35 °С, скорость подвижной фазы 600 мкл/мин, длина волны детектора 252, 276 и 360 нм [8].

Эти исследования показывают обоснованность и необходимость использования метода ВЭЖХ для анализа глицирризиновой кислоты в сырье и препаратах солодки вместо действующей многостадийной спектрофотометрической методики. В то же время известно, что при градиентном режиме может быть более критичной корректировка условий, и это может привести к некорректной идентификации пиков, их наложению или сдвигам. При анализе известных решений в научной литературе не было обнаружено результатов исследований по количественной оценке глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования.

Цель исследования — разработка методики определения количественного содержания глицирризиновой кислоты в корнях солодки с использованием метода ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования.

Материалы и методы

В качестве материала исследования были взяты корни солодки голой, заготовленные в 2018 г. в Ботаническом саду Самарского университета, коммерческие образцы растительного сырья (АО «Красногорсклексредства», ООО «АЛСУ»), государственные стандартные образцы (ГСО) монозамещенной аммониевой соли глицирризиновой кислоты (глицирам, ФС 42-0034-00) и рабочий стандартный образец глицирризиновой кислоты. Использование в качестве ГСО глицирама обусловлено тем обстоятельством, что глицирризиновая кислота — нестабильное вещество, требующее многоэтапной процедуры очистки, которая в конечном итоге не обеспечивает высокой степени чистоты выделяемого соединения.

ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка КАХ-6-80-4 (2 × 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), подвижная фаза — ацетонитрил: 1 % раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 40 : 60, скорость элюирования — 100 мкл/мин, объем элюента — 2000 мкл. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 256 нм (соответствует максимуму поглощения глицирризиновой кислоты).

Результаты и обсуждение

В процессе разработки ВЭЖХ-методики был осуществлен подбор системы растворителей (смесь ацетонитрил – 1 % водный раствор уксусной кислоты в различных соотношениях). Результаты подбора системы растворителей показали, что оптимальной системой, в которой наблюдается хорошее разделение веществ как индивидуальных, так и в извлечении, является смесь ацетонитрила и воды в соотношении 40 : 60.

С целью проверки пригодности хроматографической системы проводили 5-кратное хроматографирование 4 мкл раствора извлечения корней солодки. В дальнейшем рассчитывали следующие показатели: эффективность колонки, разрешение между пиками, фактор асимметрии. Полученные значения соответствовали нормативным показателям в соответствии с ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография».

Время удерживания пика, соответствующего глицирризиновой кислоте, на хроматограмме извлечений из исследуемых образцов корней солодки соответствовало временам удерживания пика глицирама на хроматограмме ГСО глицирама и пика глицирризиновой кислоты на хроматограмме рабочего стандартного образца (6,661 ± 0,129, 6,555 ± 0,120 и 6,665 ± 0,140 мин соответственно) (рис. 3, 4).

 

Рис. 3. Высокоэффективная жидкостная хроматограмма стандартного раствора глицирама: * — глицирам / Fig. 3. High performance liquid chromatogram of glycyram standard solution: * — glycyram

 

Рис. 4. Высокоэффективная жидкостная хроматограмма извлечения из корней солодки: * — глицирризиновая кислота / Fig. 4. High performance liquid chromatogram of the extract from licorice roots: * — glycyrrhizic acid

 

С использованием метода ВЭЖХ разработана методика количественного определения содержания глицирризиновой кислоты в сырье. Зависимость высоты хроматографического пика от концентрации глицирризиновой кислоты описывалась линейной регрессией в диапазоне концентраций от 184 до 1475 мкг/мл (r² = 0,9994). Правильность методики определяли методом добавок растворов глицирризиновой кислоты с известной концентрацией (80, 100 и 120 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 97,2 %. Ошибки определения глицирризиновой кислоты в пробах с добавками стандартных образцов находились в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Ошибка определения среднего результата содержания глицирризиновой кислоты в корнях солодки с доверительной вероятностью 95 % составляет ±4,11 % (табл. 1).

 

Таблица 1. Метрологические характеристики методики количественного определения глицирризиновой кислоты в корнях солодки / Table 1. Metrological characteristics of the method for the quantitative determination of glycyrrhizic acid in licorice roots

f	$\overline{X}$, %	S	P, %	t (P, f)	∆$\overline{X}$	$\overline{\epsilon }$, %
10	4,44	0,27131	95	2,23	±0,18	±4,11

 

Сравнительное изучение экстракционной способности спиртов разных концентраций (30, 40, 60, 70, 80 %) показало, что наиболее высокой экстракционной способностью обладают водно-спиртовые смеси с концентрацией этанола 40 % (табл. 2).

 

Таблица 2. Экстракционная способность водно-спиртовых смесей с различной концентрацией этанола / Table 2. Extraction capacity of water-alcohol mixtures with different concentrations of ethanol

Экстрагент	Соотношение сырье/экстрагент	Время экстракции, мин	Содержание глицирризиновой кислоты, %
30 % этанол	1 : 30	60	3,86 ± 0,17
40 % этанол	1 : 30	60	4,50 ± 0,16
60 % этанол	1 : 30	60	4,49 ± 0,17
70 % этанол	1 : 30	60	4,21 ± 0,15
80 % этанол	1 : 30	60	3,48 ± 0,14

 

С использованием предлагаемых методик проанализирован ряд образцов лекарственного растительного сырья (табл. 3). Содержание глицирризиновой кислоты (в пересчете на глицирам) в корнях солодки варьировало от 3,44 до 4,51 %.

 

Таблица 3. Содержание глицирризиновой кислоты в образцах сырья солодки / Table 3. Content of glycyrrhizic acid in the samples of licorice raw materials

Образец сырья	Содержание глицирризиновой кислоты, %
Корни солодки голой (г. Самара, Ботанический сад Самарского университета, август 2018 г.)	3,44 ± 0,16
Солодки корни (АО «Красногорсклексредства», 2018)	4,00 ± 0,17
Солодки корни (АО «Красногорсклексредства», 2019)	4,49 ± 0,15
Солодки корни (биологически активная добавка, серия «Травы Алтая», ООО «АЛСУ»)	4,01 ± 0,16

 

Заключение

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности стандартизации корней солодки путем определения содержания глицирризиновой кислоты с использованием метода ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования.

Разработанная методика определения количественного содержания глицирризиновой кислоты методом обращенно-фазовой ВЭЖХ предусматривает следующие условия: ультрафиолетовое детектирование (258 нм), подвижная фаза — ацетонитрил: 1 % раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 40 : 60, скорость элюирования — 100 мкл/мин, объем элюента — 2000 мкл. Валидационный анализ показал, что методика характеризуется удовлетворительными метрологическими показателями.

Подобраны оптимальные условия экстракции: экстрагент — этанол 40 %, экстракция в течение 60 мин при соотношении сырье/экстрагент 1 : 30.

Полученные результаты позволяют рекомендовать 40 % этанол в качестве экстрагента для получения общего извлечения, используемого в дальнейшем при определении количественного содержания глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Ольга Александровна Белова

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: belova_oa@pranapharm.ru

аспирант кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Россия, Самара

Владимир Александрович Куркин

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: v.a.kurkin@samsmu.ru

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Россия, Самара

Татьяна Константиновна Рязанова

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: t.k.ryazanova@samsmu.ru

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры управления и экономики фармации

Россия, Самара

Список литературы

Дополнительные файлы