Standardization of licorice roots: current issues

Full Text

Обоснование

Солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.) и солодка уральская (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) широко применяют в официальной медицине для получения лекарственных препаратов, обладающих обширным спектром фармакологической активности [4–7]. Фармакопейным сырьем для обоих видов растений служат корни [6]. Препараты на основе корней солодки (экстракты густой и сухой, солодки сироп, многокомпонентные растительные сборы, бальзамы, «Грудной эликсир» и др.) применяются в качестве противовоспалительных, отхаркивающих, антигистаминных, иммуномодулирующих, противоязвенных средств [3].

Основными биологически активными соединениями сырья и препаратов солодки голой и солодки уральской являются тритерпеновые сапонины (глицирризиновая кислота) и флавоноиды (ликуразид) (рис. 1, 2) [1, 4–7].

 

Рис. 1. Структурная формула глицирризиновой кислоты / Fig. 1. Structural formula of glycyrrhizic acid

 

Рис. 2. Структурная формула ликуразида / Fig. 2. Structural formula of licuraside

 

В настоящее время качество корней солодки оценивается по содержанию глицирризиновой кислоты, для количественного определения которой в сырье и лекарственных препаратах в России традиционно используют метод спектрофотомерии [2, 6]. В действующей фармакопейной статье «Солодки корни» (ФС.2.5.0040.15) для количественного определения этого биологически активного соединения применяют многостадийную методику, предусматривающую экстракцию сырья азотной кислоты 3 % ацетоновым раствором, добавление к полученному экстракту концентрированного раствора аммиака до появления светло-желтого творожистого осадка, фильтрование и растворение в воде полученного осадка с последующим спектрофотометрическим определением глицирризиновой кислоты при аналитической длине волны 258 нм [2].

В то же время внедрение тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), ЯМР-спектроскопии и других методов в область фармации открыло новые возможности для совершенствования стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов. В научной литературе опубликованы нефармакопейные методики определения глицирризиновой кислоты в сырье и препаратах солодки с использованием методов ВЭЖХ, капиллярного электрофореза [8–14]. Известна методика определения этого соединения методом микроколоночной ВЭЖХ. Экстракцию проводят 50 % этанолом в ультразвуковой ванне с последующим хроматографическим разделением с использованием в качестве подвижной фазы градиентной системы [4,1 М LiClO₄ в 0,1 М НClO₄ (элюент А) — ацетонитрил (элюент В); режим элюирования 10–60 % элюента В (0–5 мин)]. Температура колонки 35 °С, скорость подвижной фазы 600 мкл/мин, длина волны детектора 252, 276 и 360 нм [8].

Эти исследования показывают обоснованность и необходимость использования метода ВЭЖХ для анализа глицирризиновой кислоты в сырье и препаратах солодки вместо действующей многостадийной спектрофотометрической методики. В то же время известно, что при градиентном режиме может быть более критичной корректировка условий, и это может привести к некорректной идентификации пиков, их наложению или сдвигам. При анализе известных решений в научной литературе не было обнаружено результатов исследований по количественной оценке глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования.

Цель исследования — разработка методики определения количественного содержания глицирризиновой кислоты в корнях солодки с использованием метода ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования.

Материалы и методы

В качестве материала исследования были взяты корни солодки голой, заготовленные в 2018 г. в Ботаническом саду Самарского университета, коммерческие образцы растительного сырья (АО «Красногорсклексредства», ООО «АЛСУ»), государственные стандартные образцы (ГСО) монозамещенной аммониевой соли глицирризиновой кислоты (глицирам, ФС 42-0034-00) и рабочий стандартный образец глицирризиновой кислоты. Использование в качестве ГСО глицирама обусловлено тем обстоятельством, что глицирризиновая кислота — нестабильное вещество, требующее многоэтапной процедуры очистки, которая в конечном итоге не обеспечивает высокой степени чистоты выделяемого соединения.

ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка КАХ-6-80-4 (2 × 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), подвижная фаза — ацетонитрил: 1 % раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 40 : 60, скорость элюирования — 100 мкл/мин, объем элюента — 2000 мкл. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 256 нм (соответствует максимуму поглощения глицирризиновой кислоты).

Результаты и обсуждение

В процессе разработки ВЭЖХ-методики был осуществлен подбор системы растворителей (смесь ацетонитрил – 1 % водный раствор уксусной кислоты в различных соотношениях). Результаты подбора системы растворителей показали, что оптимальной системой, в которой наблюдается хорошее разделение веществ как индивидуальных, так и в извлечении, является смесь ацетонитрила и воды в соотношении 40 : 60.

С целью проверки пригодности хроматографической системы проводили 5-кратное хроматографирование 4 мкл раствора извлечения корней солодки. В дальнейшем рассчитывали следующие показатели: эффективность колонки, разрешение между пиками, фактор асимметрии. Полученные значения соответствовали нормативным показателям в соответствии с ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография».

Время удерживания пика, соответствующего глицирризиновой кислоте, на хроматограмме извлечений из исследуемых образцов корней солодки соответствовало временам удерживания пика глицирама на хроматограмме ГСО глицирама и пика глицирризиновой кислоты на хроматограмме рабочего стандартного образца (6,661 ± 0,129, 6,555 ± 0,120 и 6,665 ± 0,140 мин соответственно) (рис. 3, 4).

 

Рис. 3. Высокоэффективная жидкостная хроматограмма стандартного раствора глицирама: * — глицирам / Fig. 3. High performance liquid chromatogram of glycyram standard solution: * — glycyram

 

Рис. 4. Высокоэффективная жидкостная хроматограмма извлечения из корней солодки: * — глицирризиновая кислота / Fig. 4. High performance liquid chromatogram of the extract from licorice roots: * — glycyrrhizic acid

 

С использованием метода ВЭЖХ разработана методика количественного определения содержания глицирризиновой кислоты в сырье. Зависимость высоты хроматографического пика от концентрации глицирризиновой кислоты описывалась линейной регрессией в диапазоне концентраций от 184 до 1475 мкг/мл (r² = 0,9994). Правильность методики определяли методом добавок растворов глицирризиновой кислоты с известной концентрацией (80, 100 и 120 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 97,2 %. Ошибки определения глицирризиновой кислоты в пробах с добавками стандартных образцов находились в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Ошибка определения среднего результата содержания глицирризиновой кислоты в корнях солодки с доверительной вероятностью 95 % составляет ±4,11 % (табл. 1).

 

Таблица 1. Метрологические характеристики методики количественного определения глицирризиновой кислоты в корнях солодки / Table 1. Metrological characteristics of the method for the quantitative determination of glycyrrhizic acid in licorice roots

f	$\overline{X}$, %	S	P, %	t (P, f)	∆$\overline{X}$	$\overline{\epsilon }$, %
10	4,44	0,27131	95	2,23	±0,18	±4,11

 

Сравнительное изучение экстракционной способности спиртов разных концентраций (30, 40, 60, 70, 80 %) показало, что наиболее высокой экстракционной способностью обладают водно-спиртовые смеси с концентрацией этанола 40 % (табл. 2).

 

Таблица 2. Экстракционная способность водно-спиртовых смесей с различной концентрацией этанола / Table 2. Extraction capacity of water-alcohol mixtures with different concentrations of ethanol

Экстрагент	Соотношение сырье/экстрагент	Время экстракции, мин	Содержание глицирризиновой кислоты, %
30 % этанол	1 : 30	60	3,86 ± 0,17
40 % этанол	1 : 30	60	4,50 ± 0,16
60 % этанол	1 : 30	60	4,49 ± 0,17
70 % этанол	1 : 30	60	4,21 ± 0,15
80 % этанол	1 : 30	60	3,48 ± 0,14

 

С использованием предлагаемых методик проанализирован ряд образцов лекарственного растительного сырья (табл. 3). Содержание глицирризиновой кислоты (в пересчете на глицирам) в корнях солодки варьировало от 3,44 до 4,51 %.

 

Таблица 3. Содержание глицирризиновой кислоты в образцах сырья солодки / Table 3. Content of glycyrrhizic acid in the samples of licorice raw materials

Образец сырья	Содержание глицирризиновой кислоты, %
Корни солодки голой (г. Самара, Ботанический сад Самарского университета, август 2018 г.)	3,44 ± 0,16
Солодки корни (АО «Красногорсклексредства», 2018)	4,00 ± 0,17
Солодки корни (АО «Красногорсклексредства», 2019)	4,49 ± 0,15
Солодки корни (биологически активная добавка, серия «Травы Алтая», ООО «АЛСУ»)	4,01 ± 0,16

 

Заключение

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности стандартизации корней солодки путем определения содержания глицирризиновой кислоты с использованием метода ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования.

Разработанная методика определения количественного содержания глицирризиновой кислоты методом обращенно-фазовой ВЭЖХ предусматривает следующие условия: ультрафиолетовое детектирование (258 нм), подвижная фаза — ацетонитрил: 1 % раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 40 : 60, скорость элюирования — 100 мкл/мин, объем элюента — 2000 мкл. Валидационный анализ показал, что методика характеризуется удовлетворительными метрологическими показателями.

Подобраны оптимальные условия экстракции: экстрагент — этанол 40 %, экстракция в течение 60 мин при соотношении сырье/экстрагент 1 : 30.

Полученные результаты позволяют рекомендовать 40 % этанол в качестве экстрагента для получения общего извлечения, используемого в дальнейшем при определении количественного содержания глицирризиновой кислоты методом ВЭЖХ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Olga A. Belova

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: belova_oa@pranapharm.ru

Postgraduate student, Department of Pharmacognosy with Botany and Bases of Phytotherapy

Russian Federation, Samara

Vladimir A. Kurkin

Samara State Medical University

Email: v.a.kurkin@samsmu.ru

Doctor of Pharmaceutical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacognosy with Botany and Bases of Phytotherapy

Russian Federation, Samara

Tatyana K. Ryazanova

Samara State Medical University

Email: t.k.ryazanova@samsmu.ru

Candidate of Pharmaceutical Sciences, Assossiate Professor, Department of Management and Pharmaceutical Economics

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files