Актуальные аспекты фармакогностического исследования травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.)

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Обоснование. Монарда дудчатая (Monarda fistulosa L.) успешно культивируется на территории России. Известно применение травы чабреца, тимьяна обыкновенного и душицы обыкновенной в качестве средств, обладающих антимикробным, противогрибковым и противовоспалительным действием, что объясняется наличием тимола и карвакрола в сырье. Однако монарда дудчатая не уступает перечисленным растениям по содержанию данных компонентов.

Цель — изучение химического состава, выявление наиболее значимых для диагностики морфолого-анатомических и химических признаков сырья, а также разработка методов стандартизации травы Монарда дудчатой в соответствии с современными требованиями фармацевтического анализа.

Материалы и методы. Трава монарды дудчатой заготовлена в период массового цветения на территории Ботанического сада Самарского университета в 2016–2019 гг. Морфолого-анатомическое исследование осуществляли методом световой микроскопии в проходящем и отраженном свете. Люминесцентную микроскопию проводили на люминесцентном микроскопе марки «Альтами» ЛЮМ 2. Индивидуальные вещества выделяли методом колоночной хроматографии. В исследовании использовали прибор Bruker DRX 500 для определения спектров ЯМР 13С, Bruker AM 300 — для определения спектров ЯМР 1Н. Масс-спектры снимали на масс-спектрометре Kratos MS-30, регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра Specord 40 (Analytik Jena).

Результаты. В настоящей работе представлены результаты исследований в области стандартизации сырья монарды дудчатой. В результате экспериментальной работы определены характерные анатомо-морфологические признаки растения. Из травы исследуемого сырья впервые выделены доминирующие флавоноиды — изороифолин, линарин, а также другие флавоноиды — дидимин, акацетин, апигенин. Авторами получено из травы монарды дудчатой новое природное соединение — 5-О-рутинозид апигенина. Разработаны методики качественного анализа травы монарды дудчатой с использованием тонкослойной хроматографии (в присутствии тимола и рутина) и спектрофотометрии (максимумы поглощения при длине волны 270 ± 2 и 330 ± 2 нм). Разработана методика количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве Monarda fistulosa L. с использованием дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 394 нм.

Заключение. Полученные результаты использованы при составлении проекта фармакопейной статьи на новый вид сырья «Монарды дудчатой трава».

Полный текст

Введение

Монарда дудчатая (Monarda fistulosa L.) или дикий бергамот относится к семейству Яснотковые Lamiaceae [28]. В диком виде на территории Российской Федерации данный вид не встречается (родина — Северная Америка), однако монарда дудчатая успешно культивируется на территории Московской, Самарской и Новосибирской областей, в Ставропольском крае, Республике Крым и Республике Башкортостан [6, 11, 12, 14, 28].

В работах отечественных и зарубежных ученых большое внимание уделяется эфирному маслу данного вида, в составе которого чаще всего преобладают простые фенолы — тимол и карвакрол. Наряду с этими веществами в эфирном масле монарды дудчатой определяются п-цимол, линалоол, γ-терпинен, 1-октен-3-ол, β-мирцен, α-терпинен, тимохинон, карвакрола метиловый эфир, цинеол, α-пинен, камфора, камфен, фарнезол [1, 2, 5, 8, 9, 18, 21, 23, 24, 27].

Не менее интересна другая группа фенольных соединений монарды дудчатой — флавоноиды. Согласно литературным источникам, в монарде дудчатой содержатся флавоны (лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, диосмин), флавонолы (кемпферол, кверцетин, гиперозид, рутин), а также флаванон — нарингенин [2, 3, 6, 7, 16, 26]. Для сырья исследуемого растения описаны дубильные вещества, тритерпеновые сапонины (урсоловая и олеаноловая кислоты), фенилпропаноиды (розмариновая кислота), смолистые вещества [6, 22, 26].

Компонентный состав сырья обусловливает широкую направленность фармакологических свойств монарды дудчатой. Эфирное масло монарды дудчатой определяет антимикробную активность в отношении Nesseria catarralis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Enterobacater cloacae, Citrobacter OG и Serrabia marcesnes, Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis. Доказано, что эфирное масло монарды оказывает противогрибковое действие в отношении грибов Aspergillus niger и Candida albicans [4, 11, 12, 15, 18, 25, 26]. Анализ литературных данных позволил выявить и некоторые другие направления фармакологического действия сырья, а именно: противовоспалительное, антигельминтное, противовирусное, антиоксидантное, противосклеротическое, антисеборейное, иммуномодулирующее, радиопротекторное, противораковое, что подтверждает перспективность исследования травы монарды дудчатой [5, 6, 10, 13, 17, 19, 20, 25].

В настоящее время основными источниками тимола выступают такие представители семейства Lamiaceae, как тимьян обыкновенный, душица обыкновенная, чабрец. Однако монарда дудчатая ничуть не уступает перечисленным растениям. А ввиду достаточной высоты (достигает 120 см) и большой фитомассы монарда дудчатая представляется нам перспективным растением в плане механизированной заготовки сырья.

Таким образом, целью исследования стало изучение химического состава, выявление наиболее значимых для диагностики морфолого-анатомических и химических признаков сырья, а также разработка методов стандартизации травы монарды дудчатой в соответствии с современными требованиями фармацевтического анализа.

Материалы и методы

Объектом исследования служила воздушно-сухая трава монарды дудчатой, собранная в период массового цветения в 2016–2019 гг. в Самарской области на территории Ботанического сада Самарского университета. Сушка сырья проводилась естественным способом под навесами. В исследовании использовали методы морфолого-анатомического анализа, метод колоночной, тонкослойной хроматографии (ТСХ), метод спектроскопии и спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра, а также метод ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Исследование микропрепаратов в проходящем и отраженном свете проводили с помощью цифровых микроскопов марки Motic: DM-111 и DM-39C-N9GO-A. На люминесцентном микроскопе марки «Альтами» ЛЮМ 2 проводили исследование люминесценции тканей травы монарды дудчатой (с применением голубого и желтого светофильтра 32 мм). Источником света служила высоковольтная ртутная лампа (HBO 100 Вт); спектральный диапазон возбуждения люминесценции: голубой светофильтр — 420–550 нм; желтый светофильтр — 330–400 нм. Индивидуальные вещества выделяли из травы M. fistulosa на хроматографической колонке с силикагелем L 40/100. В методе ТСХ разделение проводили на пластинках Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ в системе этиловый спирт – хлороформ – вода в соотношении компонентов 26 : 16 : 3. В качестве вещества-свидетеля использовали стандартные образцы рутина и тимола. Зоны, соответствующие биологически активным веществам (БАВ), детектировали в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм. Спектрофотометрический анализ проводили на спектрофотометре Specord 40 (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10 мм в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм. Спектры ЯМР 1Н получали на приборе Bruker AM 300, спектры ЯМР 13С — на приборе Bruker DRX 500, масс-спектры снимали на масс-спектрометре Kratos MS-30.

Результаты и обсуждение

Нами был проведен морфолого-анатомический анализ травы монарды дудчатой, при этом большое внимание было уделено петиолярной анатомии. Для апикальной части черешка монарды дудчатой характерна особая U-образная форма выемки черешка. Наиболее важная для диагностики — базальная часть черешка, имеющая неправильную овальную форму, тангентально вдавленную с адаксиальной стороны, а также широко-округлую форму абаксиальной части и ребер. Стоит отметить, что угол наклона ребра к плоскости у монарды дудчатой практически равен 0°. Микроскопическое исследование стебля монарды дудчатой позволило определить его непучковое строение, уголковая колленхима обнаруживается только в ребрах стебля, лигнифицированные сосуды ксилемы располагаются угловыми секторами в его ребрах. Клетки эпидермиса стебля вытянутой многоугольной формы, без извилистости; устьичный аппарат диацитного типа; опушение слабое, состоит из простых многоклеточных волосков, эфиромасличных желёзок. Для листа монарды дудчатой характерно наличие трихом (простые одно- и многоклеточные волоски с утолщенными целлюлозными клеточными стенками и бородавчатой кутикулой, простые сосочковидные волоски, а также эфиромасличные желёзки) по обеим сторонам листа. В тканях завязи пестика и рыльца, в проводящих элементах черешка, а также по всей длине тычиночных нитей монарды дудчатой обнаружено кристаллическое включение флавоноидного происхождения.

На внутренней и наружной поверхности чашечки цветка монарды дудчатой располагаются длинные простые многоклеточные волоски, эфиромасличные желёзки, простые железистые волоски, а также редкие пельтатные железистые трихомы расположены по поверхности зубцов чашечки. По внутренней поверхности трубки венчика цветка монарды дудчатой располагаются волоски с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой, а также мелкие железистые двуклеточные трихомы.

В ходе колоночной хроматографии из травы M. fistulosa L. нами были выделены флавоноиды. Флавоны: изороифолин (7-О-рутинозид апигенина), линарин (7-О-рутинозид акацетина), апигенин, акацетин и флаванон — дидимин (7-О-рутинозид изосакурнетина) — ранее не выделялись из исследуемого вида растения. Кроме того, было получено новое природное соединение — 5-О-рутинозид апигенина (названо авторами — монардозид).

Метод колоночной хроматографии также позволил выделить из травы монарды дудчатой характерные для исследуемого вида монотерпеновые фенолы — карвакрол, тимол, тимогидрохинон (рис. 1).

 

Рис. 1. Структурные формулы индивидуальных веществ, выделенных из травы монарды дудчатой / Fig. 1. Structural formulas of individual substances isolated from the herb of Monarda fistulosa

 

Исследование микроскопических срезов травы монарды дудчатой и полученных индивидуальных веществ с использованием люминесцентного микроскопа позволило обнаружить, что цвет люминесценции кристаллического включения (было обнаружено нами по всей длине тычиночных нитей, в тканях завязи, столбика и рыльца пестика, а также в проводящих тканях черешка) соответствует люминесценции линарина и изороифолина при соответствующих длинах волн (рис. 2).

 

Рис. 2. Люминесцентная микроскопия индивидуальных веществ и кристаллического включения травы монарды: a — линарин; b — изороифолин; c — кристаллическое включение в сырье / Fig. 2. Luminescence microscopy of individual substances and crystalline inclusion of the herb of monarda: a — linarin; b — isorhoifolin; c — crystalline inclusion in the raw material

 

Характер свечения флавона апигенина (при длине волны 360 нм имеет ярко-розовое свечение, а при 420 нм — ярко-красное) соответствует характеру свечения протопластов клеток основной паренхимы черешков монарды дудчатой (рис. 3).

 

Рис. 3. Люминесцентная микроскопия индивидуального вещества монарды дудчатой и основной паренхимы: a — апигенин; b — основная паренхима черешка / Fig. 3. Luminescence microscopy of the individual substance of the Monarda fistulosa and ground parenchyma: a — apigenin; b — ground parenchyma of the petiole

 

Учитывая полученные данные о химическом составе травы монарды дудчатой, мы предлагаем методики стандартизации изучаемого сырья по двум группам БАВ — эфирному маслу (ведущая группа БАВ) и флавоноидам. Данный подход, по нашему мнению, соответствует современным тенденциям фармакопейного анализа.

Исследование, проведенное методом ТСХ, показало, что на хроматограммах водно-спиртовых извлечений травы монарды дудчатой доминирующими компонентами являются изороифолин и линарин. Данные флавоноиды при длине волны 366 нм имеют голубое и желто-бурое свечение соответственно. Ввиду отсутствия стандартных образцов изороифолина и линарина не представляется возможным использование данных веществ в качестве растворов-свидетелей при определении подлинности травы монарды дудчатой. По этой причине нами предложен показатель Rst. Показатель Rst изороифолина относительно рутина составляет 1,15, линарина — 1,30. При последующем проявлении хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокислоты на уровне пятна тимола обнаруживается пятно оранжево-красного цвета, которое соответствует смеси тимола и карвакрола.

Достаточно информативен электронный спектр водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой (рис. 4): два интенсивных максимума поглощения при длине волны λmax = 270 ± 2 и 330 ± 2 нм (флавоноиды). Изучение УФ-спектра водно-спиртового извлечения (дифференциальный вариант) показало, что основной максимум поглощения наблюдается при длине волны 394 нм (рис. 5).

 

Рис. 4. Электронные спектры водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой: 1 — извлечение; 2 — извлечение с добавлением алюминия хлорида / Fig. 4. Electronic spectra of aqueous-alcoholic extract from the herb of Monarda fistulosa: 1 — extraction; 2 — extraction with the addition of aluminum chloride

 

Рис. 5. Дифференциальный спектр водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой / Fig. 5. Differential spectrum of aqueous-alcoholic extract from herbs of Monarda fistulosa

 

При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов в сырье «Монарды дудчатой трава» были использованы ранее определенные нами оптимальные параметры: экстракция 60 % этиловым спиртом в соотношении сырье/экстрагент 1 : 50, экстракция на кипящей водяной бане в течение часа.

Для расчета содержания суммы флавоноидов нами определен удельный показатель поглощения изороифолина, который, по нашим данным, является доминирующим флавоновым гликозидом и во многом определяет спектральные характеристики. Следовательно, для количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой целесообразно использовать метод дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 394 нм, используя при этом значение удельного показателя поглощения (E1см1%) равное 195.

Заключение

В рамках проведенной работы выявлены характерные анатомо-морфологические особенности травы монарды дудчатой, выделены индивидуальные биологически активные соединения исследуемого сырья. С помощью люминесцентной микроскопии установлена взаимосвязь между характером свечения тканей и химическим составом монарды дудчатой. На основе результатов исследований разработаны методики качественного и количественного анализа действующих веществ в траве монарды дудчатой.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

Об авторах

Анастасия Сергеевна Цибина

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: a.s.tsibina@samsmu.ru

кандидат фармацевтических наук, ассистент кафедры фармакологии имени заслуженного деятеля науки РФ профессора А.А. Лебедева

Россия, Самара

Владимир Александрович Куркин

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: Kurkinvladimir@yandex.ru

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Россия, Самара

Список литературы

  1. Анищенко И.Е., Пупыкина К.А. Красюк Е.В., Жигунов О.Ю. Компонентный состав эфирных масел некоторых представителей рода Monarda L., интродуцированных в республике Башкортостан // Известия Уфимского научного центра Российской академии наук. 2017. № 3. С.71–76.
  2. Высочина Г.И. Род Monarda L. (Lamiaceae): химический состав, биологическая активность и практическое применение (обзор) // Химия в интересах устойчивого развития. 2020. Т. 28, № 2. С. 107–123. doi: 10.15372/KhUR2020209
  3. Дмитриенко С.Г., Степанова А.В., Кудринская В.А., Апяри В.В. Особенности разделения флавоноидов методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии на колонке Luna 5u C18(2) // Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. 2012. Т. 53, № 6. С. 369–373.
  4. Жилякова Е.Т., Новиков О.О., Науменко Е.Н. и др. Исследование антимикробной и противовоспалительной активности новой лекарственной формы с маслом монарды // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. 2013. № 25–1(168). С. 198–201.
  5. Исмаилова Э.Т., Шемшура О.Н., Сейтбатталова А.И. Фенольные соединения рода monarda // Доклады Национальной академии наук Республики Казахстан. 2015. № 6. С. 110–118.
  6. Красюк Е.В. Фармакогностическое исследование видов Монарды, интродуцируемых на территории Республики Башкортостан: дис. … канд. фарм. наук. Уфа, 2020.
  7. Красюк Е.В., Пупыкина К.А. Качественный анализ и разработка методики количественного определения флавоноидов в видах монарды, интродуцируемых в Республике Башкортостан // Медицинский вестник Башкортостана. 2016. Т. 11, № 5(65). С. 73–77.
  8. Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для студентов фармацевтических вузов. 5-е изд., перераб. и доп. Самара, 2020.
  9. Логвиненко Л.А., Хлыпенко Л.А., Марко Н.В. Ароматические растения семейства Lamiaceae для фитотерапии // Фармация и фармакология. 2016. Т. 4, № 4. С. 34–47. doi: 10.19163/2307-9266-2016-4-4-34-47
  10. Марченко M.A. Разработка противовоспалительного стоматологического геля на основе экстракта из травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa) // «Молодая наука–2016». Материалы научно-практической конференции. Пятигорск, 2016. С. 36–38.
  11. Мащенко З.Е. Фитохимическое исследование и стандартизация тимолсодержащих растений семейства Яснотковых: дис. … канд. фарм. наук. Пермь, 2004.
  12. Николаевский В.В. Ароматерапия: справочник. М.: Медицина, 2000.
  13. Науменко Е.Н., Жилякова Е.Т., Новиков О.О. и др. Исследование иммуномодулирующей активности эфирного масла монарды дудчатой (Monarda fistuloza) // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Естественные науки. 2012. № 21–1(140). С. 154–158.
  14. Опарин Р.В., Покровский Л.М., Высочина Г.И., Ткачев А.В. Исследование химического состава эфирного масла Monarda fistulosa L. и Monarda didyma L., культивируемых в условиях Западной Сибири // Химия растительного сырья. 2000. № 3. С. 19–24.
  15. Патент RU2452470C1/10.06.2012. Чубатова С.А., Зурабов А.Ю., Чубатова О.Ю. и др. Композиция из взвеси липосом для профилактики и лечения воздушно-капельных инфекций, в частности туберкулеза (варианты), и способ ее аэрогенной доставки.
  16. Саргсян Е.Э., Никитина А.С., Степанюк С.Н. Изучение флавоноидов травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.) // «Беликовские чтения»: материалы IV Всероссийской научно-практической конференции. Пятигорск, 2015. С. 128–129.
  17. Тихомиров А.А., Говорун М.И. Защитное действие эфирных масел при облучении животных и возможность их использования у человека // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. 2015. № 114. С. 31–38.
  18. Федотов С.В. Эфирные масла монард видов Monarda fistulosa L., Monarda didyma L., Monarda citriodora Cervantes ex Lag., их хемотипы и биологическая активность // Сборник научных трудов Государственного Никитского ботанического сада. 2015. Т. 141. С. 131–147.
  19. Хлыпенко Л.А., Логвиненко Л.А., Шевчук О.М. и др. Малораспространенные ароматические растения как источник эфирных масел широкого спектра действия // Сборник научных трудов Государственного Никитского ботанического сада. 2015. Т. 141. С. 110–117.
  20. Шутова Т.Г., Шутова А.Г., Варданян Л.Р. и др. Ингибирование окисления эмульсий ненасыщенных жирных кислот эфирными маслами монарды дудчатой и тысячелистника обыкновенного // Труды Белорусского государственного университета. 2013. Т. 8, № 1. С. 111–116.
  21. Яшкин С.Н., Агеева Ю.А. Метод структурной аналогии в бесстандартной идентификации изомерных фенолов в экстракте эфирного масла монарды дудчатой (Monarda fistulosa) // Сорбционные и хроматографические процессы. 2013. Т. 13, № 2. С. 173–181.
  22. Carron C.-A. Monarda fistulosa, a natural source of geraniol, rosmarinic acid and flavonoids // Revue suisse de viticulture, arboriculture, horticulture (Switzerland). 2009. Vol. 39, No. 4. P. 229 –235.
  23. Ghosh M., Schepetkin I.A., Özek G. et al. Essential oils from Monarda fistulosa: chemical composition and activation of transient receptor potential A1 (TRPA1) channels // Molecules. 2020. Vol. 25, No. 21. P. 4873. doi: 10.3390/molecules25214873
  24. Lawson S.K., Satyal P., Setzer W.N. The volatile phytochemistry of Monarda species growing in South Alabama // Plants (Basel). 2021. Vol. 10, No. 3. P. 482. doi: 10.3390/plants10030482
  25. Pang, J., Shen N., Yan F. et al. Thymoquinone exerts potent growth-suppressive activity on leukemia through DNA hypermethylation reversal in leukemia cells // Oncotarget. 2017. Vol. 8, No. 21. Р. 34453–34467. doi: 10.18632/oncotarget.16431
  26. Shanaida M., Jasicka-Misiak I., Makowicz E. et al. Development of high-performance thin layer chromatography method for identification of phenolic compounds and quantification of rosmarinic acid content in some species of the Lamiaceae family // J. Pharm. Bioallied Sci. 2020. Vol. 12, No. 2. P. 139–145. doi: 10.4103/jpbs.JPBS_322_19
  27. Sovova H., Sajfrtova M., Topiar M. Supercritical CO2 extraction of volatile thymoquinone from Monarda didyma and M. fistulosa herbs // J. Supercritical fluids. 2015. Vol. 105. P. 29–34. doi: 10.1016/j.supflu.2015.01.004
  28. Wild bergamot (Monarda fistulosa L.) [Электронный ресурс] // United States Department of Agriculture. Режим доступа: https://plants.usda.gov/plantguide/pdf/cs_mofi.pdf. Дата обращения: 14.08.2021.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Структурные формулы индивидуальных веществ, выделенных из травы монарды дудчатой

Скачать (208KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Люминесцентная микроскопия индивидуальных веществ и кристаллического включения травы монарды: a — линарин; b — изороифолин; c — кристаллическое включение в сырье

Скачать (252KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Люминесцентная микроскопия индивидуального вещества монарды дудчатой и основной паренхимы: a — апигенин; b — основная паренхима черешка

Скачать (213KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Электронные спектры водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой: 1 — извлечение; 2 — извлечение с добавлением алюминия хлорида

Скачать (88KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Дифференциальный спектр водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой

Скачать (84KB)
Метаданные

© Цибина А.С., Куркин В.А., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.