Current issues of the pharmacognostic study Monarda fistulosa L. herb

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

BACKGROUND: The Monarda fistulosa L. is successfully cultivated in Russia. The herbs of Thymus vulgaris, Thymus serpyllum and Origanum vulgare are used as agents with antimicrobial, antifungal and anti-inflammatory effects, it is due to the presence of thymol and carvacrol in the raw material. However Monarda fistulosa is not inferior to the listed plants.

AIM: The aim is to study the chemical composition, to identify significant morphological, anatomical and chemical signs of raw materials for diagnostics, as well as to develop methods to standardize the herb of Monarda fistulosa in accordance with the modern requirements of pharmaceutical analysis.

MATERIALS AND METHODS: The herb of Monarda fistulosa was harvested during the period of mass flowering in the Botanical Garden of Samara University in 2016-2019. Morphological and anatomical examination was carried out by the method of light microscopy in transmitted and reflected light. Luminescence microscopy was carried out on a luminescence microscope Altami LUM 2. Individual substances were isolated by column chromatography. The 13C NMR spectra was evaluated by means of the instrument Bruker DRX 500, and Bruker AM 300 was used to record 1H NMR spectra. Mass spectra were recorded on mass spectrometer Kratos MS-30; UV spectra were recorded using a Specord 40 spectrophotometer (Analytik Jena).

RESULTS: This paper discusses the results of research in the field of standardization of raw materials for Monarda fistulosa. As a result of the experimental work, characteristic anatomical and morphological features of the plant were determined. For the first time, the dominant flavonoids like isoroifolin, linarin, and other flavonoids like didimine, acacetin, apigenin were isolated from the herb of the studied raw material. The authors isolated a new natural compound 5-O-rutinoside apigenin from the herb of Monarda fistulosa. Methods for the qualitative analysis of the herb Monarda fistulosa have been developed using thin-layer chromatography (in the presence of thymol and rutin) and spectrophotometry (absorption maxima at a wavelength of 270 ± 2 and 330 ± 2 nm). A method has been developed for the quantitative determination of the total flavonoid content in the herb Monarda fistulosa L. using differential spectrophotometry at the analytical wavelength of 394 nm.

CONCLUSIONS: The obtained results were used in the drafting of the pharmacopoeial monograph for the new type of raw material “Monarda fistulosa L. herb”.

Full Text

Введение

Монарда дудчатая (Monarda fistulosa L.) или дикий бергамот относится к семейству Яснотковые Lamiaceae [28]. В диком виде на территории Российской Федерации данный вид не встречается (родина — Северная Америка), однако монарда дудчатая успешно культивируется на территории Московской, Самарской и Новосибирской областей, в Ставропольском крае, Республике Крым и Республике Башкортостан [6, 11, 12, 14, 28].

В работах отечественных и зарубежных ученых большое внимание уделяется эфирному маслу данного вида, в составе которого чаще всего преобладают простые фенолы — тимол и карвакрол. Наряду с этими веществами в эфирном масле монарды дудчатой определяются п-цимол, линалоол, γ-терпинен, 1-октен-3-ол, β-мирцен, α-терпинен, тимохинон, карвакрола метиловый эфир, цинеол, α-пинен, камфора, камфен, фарнезол [1, 2, 5, 8, 9, 18, 21, 23, 24, 27].

Не менее интересна другая группа фенольных соединений монарды дудчатой — флавоноиды. Согласно литературным источникам, в монарде дудчатой содержатся флавоны (лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, диосмин), флавонолы (кемпферол, кверцетин, гиперозид, рутин), а также флаванон — нарингенин [2, 3, 6, 7, 16, 26]. Для сырья исследуемого растения описаны дубильные вещества, тритерпеновые сапонины (урсоловая и олеаноловая кислоты), фенилпропаноиды (розмариновая кислота), смолистые вещества [6, 22, 26].

Компонентный состав сырья обусловливает широкую направленность фармакологических свойств монарды дудчатой. Эфирное масло монарды дудчатой определяет антимикробную активность в отношении Nesseria catarralis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Enterobacater cloacae, Citrobacter OG и Serrabia marcesnes, Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis. Доказано, что эфирное масло монарды оказывает противогрибковое действие в отношении грибов Aspergillus niger и Candida albicans [4, 11, 12, 15, 18, 25, 26]. Анализ литературных данных позволил выявить и некоторые другие направления фармакологического действия сырья, а именно: противовоспалительное, антигельминтное, противовирусное, антиоксидантное, противосклеротическое, антисеборейное, иммуномодулирующее, радиопротекторное, противораковое, что подтверждает перспективность исследования травы монарды дудчатой [5, 6, 10, 13, 17, 19, 20, 25].

В настоящее время основными источниками тимола выступают такие представители семейства Lamiaceae, как тимьян обыкновенный, душица обыкновенная, чабрец. Однако монарда дудчатая ничуть не уступает перечисленным растениям. А ввиду достаточной высоты (достигает 120 см) и большой фитомассы монарда дудчатая представляется нам перспективным растением в плане механизированной заготовки сырья.

Таким образом, целью исследования стало изучение химического состава, выявление наиболее значимых для диагностики морфолого-анатомических и химических признаков сырья, а также разработка методов стандартизации травы монарды дудчатой в соответствии с современными требованиями фармацевтического анализа.

Материалы и методы

Объектом исследования служила воздушно-сухая трава монарды дудчатой, собранная в период массового цветения в 2016–2019 гг. в Самарской области на территории Ботанического сада Самарского университета. Сушка сырья проводилась естественным способом под навесами. В исследовании использовали методы морфолого-анатомического анализа, метод колоночной, тонкослойной хроматографии (ТСХ), метод спектроскопии и спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра, а также метод ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Исследование микропрепаратов в проходящем и отраженном свете проводили с помощью цифровых микроскопов марки Motic: DM-111 и DM-39C-N9GO-A. На люминесцентном микроскопе марки «Альтами» ЛЮМ 2 проводили исследование люминесценции тканей травы монарды дудчатой (с применением голубого и желтого светофильтра 32 мм). Источником света служила высоковольтная ртутная лампа (HBO 100 Вт); спектральный диапазон возбуждения люминесценции: голубой светофильтр — 420–550 нм; желтый светофильтр — 330–400 нм. Индивидуальные вещества выделяли из травы M. fistulosa на хроматографической колонке с силикагелем L 40/100. В методе ТСХ разделение проводили на пластинках Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ в системе этиловый спирт – хлороформ – вода в соотношении компонентов 26 : 16 : 3. В качестве вещества-свидетеля использовали стандартные образцы рутина и тимола. Зоны, соответствующие биологически активным веществам (БАВ), детектировали в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм. Спектрофотометрический анализ проводили на спектрофотометре Specord 40 (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10 мм в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм. Спектры ЯМР 1Н получали на приборе Bruker AM 300, спектры ЯМР 13С — на приборе Bruker DRX 500, масс-спектры снимали на масс-спектрометре Kratos MS-30.

Результаты и обсуждение

Нами был проведен морфолого-анатомический анализ травы монарды дудчатой, при этом большое внимание было уделено петиолярной анатомии. Для апикальной части черешка монарды дудчатой характерна особая U-образная форма выемки черешка. Наиболее важная для диагностики — базальная часть черешка, имеющая неправильную овальную форму, тангентально вдавленную с адаксиальной стороны, а также широко-округлую форму абаксиальной части и ребер. Стоит отметить, что угол наклона ребра к плоскости у монарды дудчатой практически равен 0°. Микроскопическое исследование стебля монарды дудчатой позволило определить его непучковое строение, уголковая колленхима обнаруживается только в ребрах стебля, лигнифицированные сосуды ксилемы располагаются угловыми секторами в его ребрах. Клетки эпидермиса стебля вытянутой многоугольной формы, без извилистости; устьичный аппарат диацитного типа; опушение слабое, состоит из простых многоклеточных волосков, эфиромасличных желёзок. Для листа монарды дудчатой характерно наличие трихом (простые одно- и многоклеточные волоски с утолщенными целлюлозными клеточными стенками и бородавчатой кутикулой, простые сосочковидные волоски, а также эфиромасличные желёзки) по обеим сторонам листа. В тканях завязи пестика и рыльца, в проводящих элементах черешка, а также по всей длине тычиночных нитей монарды дудчатой обнаружено кристаллическое включение флавоноидного происхождения.

На внутренней и наружной поверхности чашечки цветка монарды дудчатой располагаются длинные простые многоклеточные волоски, эфиромасличные желёзки, простые железистые волоски, а также редкие пельтатные железистые трихомы расположены по поверхности зубцов чашечки. По внутренней поверхности трубки венчика цветка монарды дудчатой располагаются волоски с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой, а также мелкие железистые двуклеточные трихомы.

В ходе колоночной хроматографии из травы M. fistulosa L. нами были выделены флавоноиды. Флавоны: изороифолин (7-О-рутинозид апигенина), линарин (7-О-рутинозид акацетина), апигенин, акацетин и флаванон — дидимин (7-О-рутинозид изосакурнетина) — ранее не выделялись из исследуемого вида растения. Кроме того, было получено новое природное соединение — 5-О-рутинозид апигенина (названо авторами — монардозид).

Метод колоночной хроматографии также позволил выделить из травы монарды дудчатой характерные для исследуемого вида монотерпеновые фенолы — карвакрол, тимол, тимогидрохинон (рис. 1).

 

Рис. 1. Структурные формулы индивидуальных веществ, выделенных из травы монарды дудчатой / Fig. 1. Structural formulas of individual substances isolated from the herb of Monarda fistulosa

 

Исследование микроскопических срезов травы монарды дудчатой и полученных индивидуальных веществ с использованием люминесцентного микроскопа позволило обнаружить, что цвет люминесценции кристаллического включения (было обнаружено нами по всей длине тычиночных нитей, в тканях завязи, столбика и рыльца пестика, а также в проводящих тканях черешка) соответствует люминесценции линарина и изороифолина при соответствующих длинах волн (рис. 2).

 

Рис. 2. Люминесцентная микроскопия индивидуальных веществ и кристаллического включения травы монарды: a — линарин; b — изороифолин; c — кристаллическое включение в сырье / Fig. 2. Luminescence microscopy of individual substances and crystalline inclusion of the herb of monarda: a — linarin; b — isorhoifolin; c — crystalline inclusion in the raw material

 

Характер свечения флавона апигенина (при длине волны 360 нм имеет ярко-розовое свечение, а при 420 нм — ярко-красное) соответствует характеру свечения протопластов клеток основной паренхимы черешков монарды дудчатой (рис. 3).

 

Рис. 3. Люминесцентная микроскопия индивидуального вещества монарды дудчатой и основной паренхимы: a — апигенин; b — основная паренхима черешка / Fig. 3. Luminescence microscopy of the individual substance of the Monarda fistulosa and ground parenchyma: a — apigenin; b — ground parenchyma of the petiole

 

Учитывая полученные данные о химическом составе травы монарды дудчатой, мы предлагаем методики стандартизации изучаемого сырья по двум группам БАВ — эфирному маслу (ведущая группа БАВ) и флавоноидам. Данный подход, по нашему мнению, соответствует современным тенденциям фармакопейного анализа.

Исследование, проведенное методом ТСХ, показало, что на хроматограммах водно-спиртовых извлечений травы монарды дудчатой доминирующими компонентами являются изороифолин и линарин. Данные флавоноиды при длине волны 366 нм имеют голубое и желто-бурое свечение соответственно. Ввиду отсутствия стандартных образцов изороифолина и линарина не представляется возможным использование данных веществ в качестве растворов-свидетелей при определении подлинности травы монарды дудчатой. По этой причине нами предложен показатель Rst. Показатель Rst изороифолина относительно рутина составляет 1,15, линарина — 1,30. При последующем проявлении хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокислоты на уровне пятна тимола обнаруживается пятно оранжево-красного цвета, которое соответствует смеси тимола и карвакрола.

Достаточно информативен электронный спектр водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой (рис. 4): два интенсивных максимума поглощения при длине волны λmax = 270 ± 2 и 330 ± 2 нм (флавоноиды). Изучение УФ-спектра водно-спиртового извлечения (дифференциальный вариант) показало, что основной максимум поглощения наблюдается при длине волны 394 нм (рис. 5).

 

Рис. 4. Электронные спектры водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой: 1 — извлечение; 2 — извлечение с добавлением алюминия хлорида / Fig. 4. Electronic spectra of aqueous-alcoholic extract from the herb of Monarda fistulosa: 1 — extraction; 2 — extraction with the addition of aluminum chloride

 

Рис. 5. Дифференциальный спектр водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой / Fig. 5. Differential spectrum of aqueous-alcoholic extract from herbs of Monarda fistulosa

 

При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов в сырье «Монарды дудчатой трава» были использованы ранее определенные нами оптимальные параметры: экстракция 60 % этиловым спиртом в соотношении сырье/экстрагент 1 : 50, экстракция на кипящей водяной бане в течение часа.

Для расчета содержания суммы флавоноидов нами определен удельный показатель поглощения изороифолина, который, по нашим данным, является доминирующим флавоновым гликозидом и во многом определяет спектральные характеристики. Следовательно, для количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой целесообразно использовать метод дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 394 нм, используя при этом значение удельного показателя поглощения (E1см1%) равное 195.

Заключение

В рамках проведенной работы выявлены характерные анатомо-морфологические особенности травы монарды дудчатой, выделены индивидуальные биологически активные соединения исследуемого сырья. С помощью люминесцентной микроскопии установлена взаимосвязь между характером свечения тканей и химическим составом монарды дудчатой. На основе результатов исследований разработаны методики качественного и количественного анализа действующих веществ в траве монарды дудчатой.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

Anastasiya S. Tsibina

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: a.s.tsibina@samsmu.ru

Candidate of Pharmaceuticals Sciences, Assistant, Department of Pharmacology named after Honored Scientist of the Russian Federation Professor A.A. Lebedev

Russian Federation, Samara

Vladimir A. Kurkin

Samara State Medical University

Email: Kurkinvladimir@yandex.ru

Doctor of Pharmaceutical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacognosy with Botany and Bases of Phytotherapy

Russian Federation, Samara

References

  1. Anishchenko IE, Pupykina KA, Krasyuk EV, Zhigunov OYu. The component structure of essential oils from some representatives of the genus Monarda L. introduced into the republic of Bashkortostan. Izvestiya Ufimskogo nauchnogo tsentra RAN. 2017;(3):71–76. (In Russ.)
  2. Vysochina GI. Genus Monarda (Lamiaceae): chemical composition, biological activity and practical application (a review). Khimiya v interesakh ustoychivogo razvitiya. 2020;28(2):107–123. (In Russ.). doi: 10.15372/KhUR2020209
  3. Dmitriyenko SG, Stepanova AV, Kudrinskaya VA, Apyari VV. Specifics of separation of flavonoids by reverse phase high performance liquid chromatography on the Luna 5u C18(2) column. Moscow University Chemistry Bulletin. 2012;53(6):369–373. (In Russ.)
  4. Zhilyakova ET, Novikov OO, Naumenko EN, et al. Issledovanie antimikrobnoy i protivovospalitel’noy aktivnosti novoy lekarstvennoy formy s maslom monardy. Nauchnyye vedomosti Belgorodskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Meditsina. Farmatsiya. 2013;(25-1(168)):198–201. (In Russ.)
  5. Ismailova EТ, Shemshura ON, Seitbattalova AI. Phenolic compounds of plants of the monarda sorts. Reports of National academy of sciences of the Republic of Kazakhstan. 2015;(6):110–118. (In Russ.)
  6. Krasyuk EV. Farmakognosticheskoe issledovanie vidov Monardy, introduciruemyh na territorii Respubliki Bashkortostan [dissertation]. Ufa; 2020. (In Russ.)
  7. Krasyuk EV, Pupykina KA. Qualitative analysis and development of methods of quantification of flavonoids in monarda species introduced in the republic of Bashkortostan. Meditsinskiy vestnik Bashkortostana. 2016;11(5(65)):73–77. (In Russ.)
  8. Kurkin VA. Farmakognoziya: uchebnik dlya studentov farmacevticheskih vuzov. 5th ed. Samara; 2020. (In Russ.)
  9. Logvinenko LA, Khlypenko LA, Marko NV. Aromatic plant of lamiaceae family for use in phytotherapy. Farmatsiya i farmakologiya. 2016;4(4):34–47. (In Russ.). doi: 10.19163/2307-9266-2016-4-4-34-47
  10. Marchenko MA. Razrabotka protivovospalitel’nogo stomatologicheskogo gelya na osnove ekstrakta iz travy monardy dudchatoy (Monarda fistulosa). Proceedings of the nauchno-prakticheskaya konferentsiya “Molodaya nauka – 2016”. Pyatigorsk; 2016. P. 36–38. (In Russ.)
  11. Mashchenko ZE. Fitokhimicheskoye issledovaniye i standartizatsiya timolsoderzhashchikh rasteniy semeystva Yafsnotkovykh [dissertation]. Perm’; 2004. (In Russ.)
  12. Nikolayevskiy VV. Aromaterapiya: spravochnik. Moscow: Meditsina; 2000. (In Russ.)
  13. Naumenko EN, Zhilyakova ET, Novikov OO, et al. Issledovaniye immunomoduliruyushchey aktivnosti efirnogo masla monardy dudchatoy (Monarda fistuloza). Nauchnyye vedomosti Belgorodskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Estestvennyye nauki. 2012;(21–1(140)):154–158. (In Russ.)
  14. Oparin RV, Pokrovskij LM, Vysochina GI, Tkachev AV. Issledovanie himicheskogo sostava efirnogo masla Monarda fistulosa L. i Monarda didyma L., kul’tiviruemyh v usloviyah Zapadnoj Sibiri. Khimija Rastitel’nogo Syr’ja. 2000;(3):19–24. (In Russ.)
  15. Patent RU2452470C1/10.06.2012. Chubatova SA, Zurabov AYu, Chubatova O.Yu, et al. Kompozitsiya iz vzvesi liposom dlya profilaktiki i lecheniya vozdushno-kapel’nykh infektsiy, v chastnosti tuberkuleza (varianty), i sposob ee aerogennoy dostavki. (In Russ.)
  16. Sargsyan EE, Nikitina AS, Stepanyuk SN. Izucheniye flavonoidov travy monardy dudchatoy (Monarda fistulosa L.). Proceedings of the IV All-Russian Scientific and Practical Conference “Belikovskie chteniya”. Pyatigorsk; 2015. P. 128–129. (In Russ.)
  17. Tikhomirov AA, Govorun MI. Protective action of essential oils in case of animal irradiation and possible appliance for human. Bull of the State Nikit Botan Gard. 2015;(114):31–38. (In Russ.)
  18. Fedotov SV. Monarda essential oils of Monarda fistulosa L., Monarda didyma L., Monarda citriodora cervantes ex lag., their chemotypes and biological activity. Sbornik nauchnykh trudov Gosudarstvennogo Nikitskogo botanicheskogo sada. 2015;141:131–147. (In Russ.)
  19. Khlypenko LA, Logvinenko LA, Shevchuk OM, et al. Rare aromatic plants as a source of broad-spectrum essential oils. Sbornik nauchnykh trudov Gosudarstvennogo Nikitskogo botanicheskogo sada. 2015;141:110–117. (In Russ.)
  20. Shutova TG, Shutova AG, Vardanyan LR, et al. Ingibirovanie okisleniya emul’sij nenasyshchennyh zhirnyh kislot efirnymi maslami monardy dudchatoj i tysyachelistnika obyknovennogo. Proceedings of the Belarusian State University. Series of Physiological, Biochemical and Molecular Biology Sciences. 2013;8(1):111–116. (In Russ.)
  21. Yashkin SN, Ageeva A. Metod strukturnoy analogii v besstandartnoy identifikatsii izomernykh fenolov v ekstrakte efirnogo masla monardy dudchatoy (Monarda fistulosa). Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy. 2013;13(2):173–178. (In Russ.)
  22. Carron C-A. Monarda fistulosa, a natural source of geraniol, rosmarinic acid and flavonoids. Revue suisse de viticulture, arboriculture, horticulture (Switzerland). 2009;39(4):229 –235.
  23. Ghosh M, Schepetkin IA, Özek G, et al. Essential oils from Monarda fistulosa: chemical composition and activation of transient receptor potential A1 (TRPA1) channels. Molecules. 2020;25(21):4873. doi: 10.3390/molecules25214873
  24. Lawson SK, Satyal P, Setzer WN. The volatile phytochemistry of Monarda species growing in South Alabama. Plants (Basel). 2021;10(3):482. doi: 10.3390/plants10030482
  25. Pang, J, Shen N, Yan F, et al. Thymoquinone exerts potent growth-suppressive activity on leukemia through DNA hypermethylation reversal in leukemia cells. Oncotarget. 2017;8(21):34453–34467. doi: 10.18632/oncotarget.16431
  26. Shanaida M, Jasicka-Misiak I, Makowicz E, et al. Development of high-performance thin layer chromatography method for identification of phenolic compounds and quantification of rosmarinic acid content in some species of the Lamiaceae family. J Pharm Bioallied Sci. 2020;12(2):139–145. doi: 10.4103/jpbs.JPBS_322_19
  27. Sovova H, Sajfrtova M, Topiar M. Supercritical CO2 extraction of volatile thymoquinone from Monarda didyma and M. fistulosa herbs. J Supercritical fluids. 2015;105:29–34. doi: 10.1016/j.supflu.2015.01.004
  28. Wild bergamot (Monarda fistulosa L.) [Internet]. United States Department of Agriculture. Available from: https://plants.usda.gov/plantguide/pdf/cs_mofi.pdf. Accessed: 14.08.2021.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Structural formulas of individual substances isolated from the herb of Monarda fistulosa

Download (208KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Luminescence microscopy of individual substances and crystalline inclusion of the herb of monarda: a — linarin; b — isorhoifolin; c — crystalline inclusion in the raw material

Download (252KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Luminescence microscopy of the individual substance of the Monarda fistulosa and ground parenchyma: a — apigenin; b — ground parenchyma of the petiole

Download (213KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Electronic spectra of aqueous-alcoholic extract from the herb of Monarda fistulosa: 1 — extraction; 2 — extraction with the addition of aluminum chloride

Download (88KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Differential spectrum of aqueous-alcoholic extract from herbs of Monarda fistulosa

Download (84KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2021 Tsibina A.S., Kurkin V.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies