Method of quantitative determination of total flavonoids in the flowers of Acer tataricum L.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Род Клен (Acer L.) относится к семейству Кленовые (Aceraceae), включает около 129 видов, распространенных преимущественно в умеренных широтах Северного полушария (Восточная Азия, Северная Америка, Европа). Многие виды клена традиционно применяются в народной медицине для лечения различных заболеваний. Экстракты различных видов клена (Acer) оказывают антиоксидантное, противовоспалительное, гипогликемическое, гепатопротекторное и потенциальное антиканцерогенное действие, что обусловлено наличием разнообразных биологически активных соединений в их составе [1].

Клен татарский (Acer tataricum L.), также известный как черноклен, представляет собой листопадное древовидное растение или крупный кустарник, достигающий высоты 8 метров. Ареал его распространения охватывает регионы Центральной, Восточной и Юго-Восточной Европы, Малой Азии, а также Кавказ [2–4].

Химический состав клена татарского включает разнообразные биологически активные вещества. Основную группу составляют фенольные соединения, которые определяют фармакологические свойства растения, в частности его противомикробную активность. В листьях клена татарского содержатся фенольные соединения (включая метилгаллат, дубильные вещества), циклитолы (например, квебрахит), сапонины [5], однако данные о наличии флавоноидов в данном сырье практически отсутствуют. Имеются литературные сведения о содержании суммы флавоноидов в листьях других видах рода Acer. Так, в листьях клена ясенелистного содержание суммы флавоноидов составляет (1,88%), клена остролистного (0,84%) [6], в цветках клена ясенелистного (1,75%) [7]. Следовательно, актуальным является изучение флавоноидов в цветках клена татарского.

ЦЕЛЬ

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для разработки методики применяли цветки клена татарского, собранные в лесном массиве «Дубки» (район Сокольи Горы, г. Самара). Сушку растительного сырья проводили в естественных условиях при комнатной температуре, без воздействия прямого солнечного света. В качестве метода исследования использована прямая и дифференциальная спектрофотометрия в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» ГФ РФ XV издания¹. Спектральные характеристики водно-спиртовых извлечений оценивали на спектрофотометре Specord 40 (Analytik Jena AG, Германия) в диапазоне длин волн 190–500 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительное изучение УФ-спектров водно-спиртовых извлечений из цветков клена татарского и раствора рутина (рисунки 1–4) показало, что в обоих случаях наблюдается батохромный сдвиг в длинноволновой области УФ-спектров в присутствии AlCl₃ при 412±2 нм, что характерно для рутина [8–11]. Поэтому разработанная методика основана на реакции комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия (AlCl₃) с использованием в качестве стандартного образца (СО) рутина и аналитической длины волны 412 нм.

 

Рисунок 1. УФ-спектры раствора водно-спиртового извлечения из цветков клена татарского (1) и раствора водно-спиртового извлечения из цветков клена татарского с добавлением алюминия хлорида (2).

Figure 1. UV spectra of an water-alcohol extract of Acer tataricum L. flowers (1) and an water-alcohol extract of Acer tataricum L. flowers with added aluminum chloride (2).

 

Рисунок 2. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из цветков клена татарского (дифференциальный спектр).

Figure 2. UV spectrum of an water-alcohol extract of Acer tataricum L. flowers (differential spectrum).

 

Рисунок 3. УФ-спектры раствора рутина (1) и раствора с добавлением алюминия хлорида (2).

Figure 3. UV spectra of a rutin solution (1) and a solution containing aluminum chloride (2).

 

Рисунок 4. УФ-спектр раствора рутина (дифференциальный спектр).

Figure 4. UV spectrum of rutin solution (differential spectrum).

 

В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из цветков клена татарского в дифференциальном варианте обнаруживается максимум поглощения при длине волны 412 нм (рисунок 4), который близок к максимуму спиртового раствора рутина (рисунок 2) [8–11]. Для количественного определения флавоноидных соединений были оптимизированы условия экстракции: в качестве экстрагента использовали 70% этанол, соотношение «сырье:экстрагент» составило 1:50, степень измельчения 2 мм, продолжительность экстракции – 45 мин при нагревании на водяной бане с обратным холодильником (таблица 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Влияние различных факторов на полноту извлечения флавоноидов из цветков клена татарского

Influence of various factors on the completeness of extraction of flavonoids from the flowers of Acer tataricum L.

	Соотношение «сырье: экстрагент»	Время экстракции, мин	Степень измельчения, мм	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье (в %)
Экстрагент
Этиловый спирт 40%	1:50	45	2	1,62±0,04%
Этиловый спирт 50%				1,65±0,05%
Этиловый спирт 60%				1,76±0,05%
Этиловый спирт 70%				2,01±0,05%
Этиловый спирт 80%				1,82±0,04%
Этиловый спирт 90%				1,80±0,05%
Этиловый спирт 96%				1,75±0,05%
Время экстракции
70% этиловый спирт	1:50	30	2	1,85±0,04%
		45		2,29±0,05%
		60		1,89±0,04%
		90		1,75±0,04%
Степень измельчения
70% этиловый спирт	1:50	45	1	1,85±0,04%
			2	1,92±0,05%
			3	1,86±0,04%
Соотношение «сырье:экстрагент»
70% этиловый спирт	1:20	45	2	1,82±0,05%
	1:30			1,87±0,05%
	1:50			1,90±0,05%

 

Методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки.

Приготовление раствора стандартного образца рутина

Около 0,0048 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутин). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б рутина). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения Б рутина). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

$X=\frac{A\ast m_0\ast V\ast V_1\ast V_4\ast 100\ast 100\%}{A_0\ast m\ast V_2\ast V_0\ast V_3\ast (100-W)},$

где A – оптическая плотность испытуемого раствора; A_o – оптическая плотность раствора СО рутина; m – масса сырья, г; m_о – масса СО рутина, г; W – потеря в массе при высушивании, %; V – объем извлечения; V₁ – объем испытуемого раствора А; V₂ – объем аликвоты извлечения; V₀ – объем раствора А рутина; V₃ – объем раствора Б рутина СО; V₄ – объем аликвоты раствора А рутина.

В случае отсутствия СО рутина целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 412 нм – 240 [12].

$X=\frac{A\ast 50\ast 25\ast 100}{m\ast 240\ast (100-W)},$

где A – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 240 – удельный показатель поглощения (E ) СО рутина при 412 нм; W – потеря в массе при высушивании, %.

Критерием оценки аналитической методики является валидационная оценка [13–14]. Валидацию методики проводили в соответствии с ГФ РФ XV издания.

Валидационная оценка разработанной методики проводилась по следующим показателям: специфичность, линейность, правильность.

Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов цветков клена татарского и раствора СО рутина с алюминия хлоридом (дифференциальный вариант).

Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,008 до 0,038 мг/мл) с алюминия хлоридом при длине волны 412 нм. На основании полученных данных строили график зависимости значений оптической плотности растворов рутина с алюминия хлоридом от концентрации рутина и затем рассчитывали уравнение линейной регрессии (рисунок 5; таблица 2).

 

Рисунок 5. Зависимость значений оптической плотности раствора рутина с алюминия хлоридом от концентрации рутина (дифференциальный вариант).

Figure 5. Dependence of the optical density values of a rutin solution with aluminum chloride on the concentration of rutin (differential version).

 

Таблица 2 / Table 2

Исходные данные для оценки линейности методики

Initial data for assessing the linearity of the methodology

Концентрация раствора стандартного образца рутина, мг/мл	Значение оптической плотности, е.о.п. (среднее значение из трех последовательных измерений)
0,008	0,1641
0,015	0,3316
0,023	0,4856
0,038	0,8118

 

При изучении линейной зависимости вида y = bx + a коэффициент корреляции составил 1, следовательно, данную методику можно использовать для анализа суммы флавоноидов в цветках клена татарского в пересчете на рутин в указанном диапазоне концентраций (рисунок 5; таблица 2).

Метрологические характеристики методик количественного определения содержания суммы флавоноидов в водно-спиртовом извлечении цветков клена татарского представлены в таблице 3. Ошибка единичного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского с доверительной вероятностью 95% составляет ±1,67%.

 

Таблица 3 / Table 3

Результаты оценки прецизионности методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках клена татарского (уровень повторяемости)

Results of the precision assessment of the method for quantifying the sum of flavonoids in the flowers of Acer tataricum L. (repeatability level)

n	F	X¯,%	S2	S	SX¯	P, %	t (P, f)	±∆X	±∆X¯	E, %	E¯ ,%
11	10	1,90	0,0010	0,0319	0,014	95	2,23	±0,07	±0,03	±1,67	±3,74

 

Таким образом, исходя из результатов валидационной оценки результатов эксперимента, можно сделать вывод о пригодности использования данной методики для количественной оценки суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

С использованием этой методики было проанализировано три образца цветков клена татарского, заготовленных в летний период. Определено, что содержание суммы флавоноидов в анализируемых образцах, собранных в Самарской области, варьирует от 1,89±0,05% до 2,01±0,05% в зависимости от времени сбора растительного сырья (таблица 4). На наш взгляд, для обоснования числового показателя – суммы флавоноидов в цветках клена татарского целесообразно проведение дальнейших исследований на примере образцов сырья из других регионов Российской Федерации.

 

Таблица 4 / Table 4

Содержание суммы флавоноидов в образцах цветков клена татарского (в %) в пересчете на рутин

Content of the sum of flavonoids in samples of Acer tataricum L. flowers (in %) in rutin equivalent

Характеристика образца сырья	Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (в %) в пересчете на рутин
Лесной массив «Дубки» в районе Сокольих Гор, г. Самара (июнь 2025 г.) фаза бутонизации Дата сбора: 06.06.2025 г.	1,89±0,05%
Лесной массив «Дубки» в районе Сокольих Гор, г. Самара (июнь 2025 г.) фаза цветения Дата сбора: 13.06.2025 г.	2,01±0,05%
Лесной массив «Дубки» в районе Сокольих Гор, г. Самара (июнь 2025 г.) конец цветения Дата сбора: 21.06.2025 г.	1,95±0,05%

 

ВЫВОДЫ

Таким образом, в результате проведенного исследования разработана методика количественного анализа суммы флавоноидов в цветках клена татарского с использованием СО рутина при аналитической длине волне 412 нм. Определено, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках клена татарского, собранных в Самарской области, варьируется от 1,89±0,05% до 2,01±0,05%. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±1,67%.

Проведена валидационная оценка разработанной методики по показателям специфичность, линейность в соответствии с ГФ РФ XV издания. Исходя из результатов валидационной оценки результатов эксперимента, можно говорить о пригодности использования данной методики для количественной оценки суммы флавоноидов в пересчете на рутин в цветках клена татарского.

Полученные результаты исследования могут быть использованы при разработке нормативной документации на перспективный вид лекарственного растительного сырья «Клена татарского цветки» для внедрения в Государственную фармакопею Российской Федерации.

¹ Государственная фармакопея Российской Федерации. Пятнадцатое издание. М., 2024. Доступно по: https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-15

About the authors

K. R. Khozinova

Samara State Medical University

Email: kamilahozinova@gmail.com
ORCID iD: 0009-0007-8581-8563

postgraduate student of the Department of Pharmacognosy with Botany and the basics of Phytotherapy

Russian Federation, Samara

V. A. Kurkin

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: v.a.kurkin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7513-9352

Dr. Sci. (Pharmacy), Professor, Head of the Department of Pharmacognosy with Botany and the basics of Phytotherapy

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files